基因工程期末复习

这是我整理的老师布置的思考题，不一定齐全也不一定正确，不过可以选择性地参考下。1、DNA 提取常见问题，原因分析及其对策问题一：DNA 样品不纯，抑制后续酶解和 PCR 反应。原因：1.DNA 中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 2.DNA 在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 3.DNA 中残留有金属离子对策：1.重新纯化 DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）2.重新沉淀 DNA，让酒精充分挥发 3•增加 70%乙醇洗涤的次数（2-3 次）问题二：DNA 降解。原因：1.材料不新鲜或反复冻融 2.未很好抑制内源核酸酶的活性 3.提取过程操作过于剧烈，DNA 被机械打断 4•外源核酸酶污染 5.反复冻融对策：1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融2. 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液3. 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的 DNA 时，可增加裂解液中螯合剂的含量4. 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5. 所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌6•将 DNA 分装保存于缓冲液中，避免反复冻融问题三：DNA 提取量少。原因：1.实验材料不佳或量少 2.破壁或裂解不充分 3.沉淀不完全 4.洗涤时DNA 丢失对策：1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料 2•动植物要匀浆研磨充分；G+菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁 3.高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加 PK 的用量）4•低温沉淀，延长沉淀时间 5•加辅助物，促进沉淀 6.洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒2、猪肝脏总 RNA 的提取？RNA 提取常见问题，原因分析及其对问题一：RNA 的降解（1）新鲜细胞或组织的 RNA 降解RNA 降解：1.裂解液的质量 2•外源 RNase 的污染 3.裂解液的用量不足4.组织裂解不充分 5.另外某些富含内源酶的样品（如脾脏，胸腺等），很难避免 RNA 的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。（2）冷冻样品的 RNA 降解1. 样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70°C 冰箱保存。样品要相对小一点；2. 先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；3.样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。问题二：0D260/0D280 比值偏低（1）蛋白质污染；（2）苯酚残留；（3）抽提试剂残留；（4）设备限制。问题三：电泳带型异常（1）非变性电泳：上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm,电泳缓冲液陈旧，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。（2）变性电泳条带变淡...