分子生物学实验指导

精品文档---下载后可任意编辑（补充讲义）南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心二 OO 九年十二月目录实验总 RNA 的提取、定量与 RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒 DNA 的提取、定量与酶切鉴定……………………………………………7 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳………………………………………………………13 附录Ⅰ相关试剂盒说明书………………………………………………………………19 附录Ⅱ相关仪器使用说明书…………………………………………………………… 19 实验九总 RNA 的提取、定量与 RT-PCR 一、总 RNA 的提取与定量目的：从细胞中分离 RNA 是分子生物学实验常常进行的操作之一，所提取 RNA 的质量是进行其它实验的基础，如 Northern 杂交，目的基因 cDNA 的克隆，荧光定量，文库构建等。原理：在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有 10-5μg RNA，其中 rRNA 占总量的 80%-85%，tRNA 和核内小分子 RNA 占 10-15%，而 mRNA 只占 1-5%。rRNA 由 28S、18S、5S 等几类组成，这些 RNA 分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA 分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数 mRNA 分子（除血红蛋白、有些组蛋白 mRNA 以外），在 3’端存在 20-250 个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离 mRNA。RNA 分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶 K-细胞质 RNA 提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是 Trizol 法。Trizol 试剂适用于从细胞和组织中快速分离 RNA。TRIzol 的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制 RNA 酶活性，因此 Trizol 中还加入了 8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源 RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA 选择性地进入无 DNA 和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收 RNA；用乙醇沉淀中间层可回收 DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。Trizol 试剂可用于小量样品（50~100mg 组织、5×106 细胞）也适用于大量样品（≥1g 组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适...