6种方法测定蛋白质含量.

精品文档6 种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3⑴2NH3+H2SO4一一（NH4bSO4（2）（NH4）2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3（3）反应（1）、（2）在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入 CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以 6．25 即得。二、双缩脲法（biuret 法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经 180°C 左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与 CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。精品文档紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为 1-10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris 缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（二）试剂与器材1.试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成 10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用 bsa 浓度 1mg/ml 的 a280 为 0.66 来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用 H2O 或0.9%NaCI 配制，酪蛋白用 0.05NaOH 配制。（2）双缩脲试剂:称以 1.50 克硫酸铜（CuSO4・5H2O）和 6.0 克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6・4H2O）,用 500 毫升水溶解，在搅拌下加入 300 毫升 10%NaOH 溶液，用水稀释到 1 升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。2.器材：可见光分光光度计、大试管...