1 实验一 胰蛋白酶的结晶及活力测定 原理 胰蛋白酶（trypsin，EC.3.4.21.4）通常是以无活性的胰蛋白酶原（trypsinogen）形式存在于动物的胰脏中。在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌到十二指肠后，在小肠上腔有钙离子的环境中被肠激酶（enterokinase）或胰蛋白酶所激活，其肽链 N 端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解而失去一个酸性 6 肽，分子构象发生改变，转变成有生物活性的胰蛋白酶。 胰蛋白酶原的 Mr 约为 24000，其等电点为 pH8.9。胰蛋白酶的的 Mr 为 23400，等电点为 pH10.8。胰蛋白酶在酸性条件下稳定。通常在 pH3.0 的溶液内，在 4 的冰箱内储存数约乃至 2 年其活性无显著变化。当溶液的 pH 值小于 2.5 时，胰蛋白酶易变性；pH 大于 5.0 时，容易发生自溶；在 pH7.6~8.0 时，其催化水解的活性最佳。 重金属离子，有机磷化合物和某些反应产物均可抑制胰蛋白酶的活性。在胰脏、卵清和大豆中含有一些对胰蛋白酶活性具有抑制作用的天然抑制剂。 胰蛋白酶催化水解蛋白质的能力，表现在它对碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸所形成的肽键具有高度的专一性。此外，还能催化水解有碱性氨基酸所形成的酰胺键和酯键，胰蛋白酶对这些化学键催化水解活性的敏感性依次是酯键＞酰胺键＞肽键。因此，可以利用含有这些化学键的人工合成的化合物为底物来研究胰蛋白酶的专一性催化活性。 在动物的胰脏中除了存在胰蛋白酶外，还有另外两种与胰蛋白酶的性质相似的蛋白水解酶，即：胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）亦称糜蛋白酶，弹性蛋白酶(elastase)。在制备过程，采用常规的方法往往很难将三者彼此分离开。而采用具有高度专一性的亲合层析法可将它们分开。 从胰脏中提取胰蛋白酶，一般是用稀酸将胰腺细胞中含有的胰蛋白酶原提取出来，然后根据等电点沉淀的原理将提取液的 pH 调至酸性（pH3.0 左右），使大量的酸性蛋白沉淀析出。经硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原，胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原沉淀，抽滤后的沉淀物经水溶解并调至 pH8.0，用极少量的胰蛋白酶将胰蛋白酶原激活，同时溶液中的胰凝乳蛋白酶原、弹性蛋白酶原也被激活。三种酶原激活相互作用过程如下： 流程图 2 激活后的酶溶液，用硫酸铵分级盐析法初步将胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶分开，收集胰蛋白酶部分，通过结晶进一步纯化，使胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶通过离子交换层析可进一步分离。 胰蛋白酶能水解酯键、酰胺...
