HRP 标记抗体的方法(戊二醛二步法和简易过碘酸钠法) 一、戊二醛二步法 戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。 二、简易过碘酸钠法 本法是以 NaIO4 先将 HRP 表面的糖分子氧化成醛基，然后再与 Ig 上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近 70%的 HRP 和 Ig 结合，99%的 Ig 与酶结合，酶与 Ig 的活性无重大损失，是目前最常用的方法。 1. 原理 戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。 2. 标记步骤 （1）称取 HRP25mg 溶于 1.25%戊二醛溶液中，于室温静置过夜。 （2）反应后的酶溶液经 Sephadex G-25 层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在 1ml/1 分钟，收集棕色流出液。如体积大于 5ml，则以 PEG 浓缩至 5ml。放置 25ml 小烧杯中，缓慢搅拌。 （3）将待标记的抗体 12.5mg 用生理盐水稀释至 5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。 （4）用 1M PH9.5 碳酸缓冲液 0.25ml，继续搅拌3 小时。 （5）加0.2M 赖氨酸 0.25ml，混匀后，置室温 2 小时。 （6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置 4℃ 1 小时。 （7）3000rpm 离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4 的 PBS 中。 （8）将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 的PBS 缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm 离心30 分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。 3. 结果判定 （1）定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接 ELISA 法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选择)。 （2）定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程 1cm)。 酶量(mg/ml)＝OD403nm× 0.4 IgG 量(mg/ml)＝(OD280nm-OD403nm× 0.42)× 0.94× 0.62 （3）本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有 2-4%的酶与蛋白质结合。 4. 试剂及器材 （1）0.1M PH6.8 磷酸缓冲盐水(PBS)：取 0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8 克，加蒸馏水至 200ml。 （2）1.25%戊二醛液：取 25%戊二醛 50ml 与 PH6.8 的PBS...
