Protocol No. PT140726-1 Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程 Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程 Protocol No. PT140726-1 Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程 1，CRISPR-Cas9 基因编辑实验流程图如下： pGK1.1 设计2 条单链oligo 序列；退火形成双链DNA。 将双链DNA 连接到载体中。 转化 G10 Competent Cell；筛选阳性克隆；测序验证序列；质粒大提；电转染靶细胞。 在细胞内crRNA 识别靶位点，Cas9 对靶位点进行随机剪切。 CruiserTM 酶切细胞池，计算突变率；CruiserTM 酶切初筛阳性克隆；将阳性克隆测序验证；做敲除序列比对分析。 U6 CACCG CAAA 1 2 3 4 5 5’ -5’ 3’ -3’ - - ～20bp Protocol No. PT140726-1 Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程 2，操作步骤 实验前，请您务必做好以下验证实验： A． 单细胞生长情况，确保单个细胞可以正常生长形成单克隆，即，低密度的细胞在培养皿中可以形成单克隆。 B． 目的基因的表达情况分析，为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失，首先需要 PCR 扩增靶基因，并对 PCR 结果进行测序，确保靶基因的完整存在；其次，您还可以用 RT-PCR 分析靶基因的活跃度。 1. 设计 Oligo DNA 序列 首先，您需要在靶标 DNA 区域中设计一对 20bp 左右的 oligo DNA，您可以通过以下在线工具设计： ●麻省理工学院的 CRISPR Design：http://crispr.mit.edu/ ●德国癌症研究中心的 E-Crisp：w w w .e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr 下面我们选择麻省理工学院的 CRISPR Design 工具来做设计举例，以 Fu t8 基因为例，一次只能输入大小为 23～250bp 的基因片段，最好一次只输入一个外显子，避免Guide 序列跨内含子的。 点击“Dow nload as genbank”按钮，出现以下界面：“Fut8” 根据左边的 score 的高低选取合适的 Guide 序列，以 Guide#1 序列为例，2 条单链 oligo 的序列如下（红色字体部分是要与 BbsI 酶切后的载体相互补的部分）： Fut8-F: caccG AATGAGCATAATCCAACGCC Fut8-R: aaacGGCGTTGGATTATGCTCATTC ※注意：oligo DNA 设计序列的第一个碱基必须是 G，如果你选取的 Guide 序列的第一个碱基不是 G，可自行加一个 G 上去。 另外，需在位点上下游各设计一条引物，用于后续 PCR 或测序检测阳性克隆，引物能扩增约 300bp的 DNA 片段...
