siRNA导入细胞的策略

siRNA 导入细胞的策略siRNA 导入哺乳动物细胞的策略RNAi 在哺乳动物细胞中通常用于阻断特定基因的表达从而研究基因的功能。成功的进行 RNAi 的问题在于使 siRNA 导入细胞，常见的做法是将靶向特定基因的大约 21 碱基长短的双链 siRNAs(small interfering RNAs)，或者是 45—50-mer的发夹结构 RNA（small hairpin RNA, shRNA）转染到细胞。此外，通过质粒表达 siRNAs 同样可以抑制特定基因的表达。1.1 siRNA 的转染— 将一种特殊构建的ｓｉＲＮＡ对称性 3′突出 2nt 的约 21nt (nucleotide)siRNAs双链复合物通过阳离子脂质体可以转入哺乳动物细胞中。1.2 shRNA 转染引入细胞45—50-mer 的发夹结构 RNA（small hairpin RNA, shRNA）转染到细胞。shRNA在细胞内会自动被加工成为 siRNA，从而引发基因沉默或者表达抑制。1.3 胞内表达 siRNA 体内载体合成 siRNA, 是最近迅速发展起来的新技术。它是 2 0 0 2 年 2 月 ,由Patrick 等首先报道的利用载体在细胞体内稳定地表达 siRNA ,从而抑制哺乳动物细胞靶基因表达的方法[1,2] 。其基本思路如下 :细胞内存在 RNA polymerase III,它可以识别Ｕ 6 启动子 ,从而使启动子后的基因转录成ＲＮＡ。当模板连续出现 3 ～ 5“” 个 Ｔ 碱基时 , 转录就会终止。根据这一机制 ,可以设计一种能表达ＲＮＡ 的质粒 , 其组成包括四部分 :① 常用质粒的基本序列 ;② Ｕ 6 启动子 ,位于克隆位 点的上游 ;③ 克隆位点 ;④ ＲＮＡｉ模板序列 (ＤＮＡ)。这部分序列具有如下特点: 含 RNAi 序列 , 对哺乳动物而言 ,通常为 21-23 个核苷酸；发卡结构环状部分 , 通常有 4 ～ 7 个核苷酸 ;靶序列的反向互补序列; 3～5“个核苷酸 T”。将具有如上结构的质粒导入细胞内, 体内的 RNA polymerase III 就可以合成一条ＲＮＡ链 , 这条ＲＮＡ链可以通过两端的 2 1 个左右的核苷酸反向互补特性而形成发卡样 双链结构 , 从而起到基因抑制作用。这种技术的使用 , 操作简便 , 成本低 ,与直接导入 SiRNA 相比 ,DNA 质粒更易导入细胞内 ,而且质粒导入细胞后存在时间长 且稳定 , 对靶基因的表达抑制效率高 , 便于进行较长时间的基因功能研究 ,因而近 日来成为一种热门技术 ,Cythla 等 2002-05 对载体进行了改进 ,使 RNAi 效率提高 到 99%以上[3] 。他们的作法是 ,在上述载体的克降位点上游加入了人...