电转化注意事项

电转化注意事项 作者: global.w un (站内联系 TA) 发布: 2009-10-20 一、 制备感受态的菌液收集时间： 1、准确测定 OD 值：OD 在1.2～1.5之间。 1） 为了准确测定 OD 值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其 OD 值是否呈线性关系）。每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断 OD 值是否准确！菌液看上去浑浊，但 OD 值不高，很可能 OD 稀释倍数不够！ 2） OD 值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm 离心5min）约0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。 2、75ml 的菌，经18h 左右的培养，最后 sorbital 洗涤完毕后，50ml 离心管里所剩菌体特别浓，需要1ml sorbitol 才可溶解为糊状。正常培养的 OD 在1.2～1.5之间的500ml 菌液，收集的感受态也用1ml 稀释的，没那么粘稠。可以看看降低培养温度（27摄氏度）或缩短培养时间（12h）。 3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50－100mlYPD 中摇过夜，效果也很好 二、制备感受态的菌液量 如果只转一个样品，50ml 就够了，一般50ml 的培养液如果OD 值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。用大试管摇5ml 菌液，然后取1ml 毫升在1.5mlEP 管中制感受态，每一步的离心时间30秒就行。整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。 山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。 三、感受态的保存 感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。如果感受态细胞要保存，不需要加甘油，一般80ul EP 管分装，-70 或 -80 摄氏度保存。 另附：酵母GS115点种分离纯化 接种GS115于5ml YPD 液体培养基，30℃，200rpm 振荡过夜，涂布 YPD 平板，30℃培养48 小时，用 YNB 基本培养基和含 His 的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划 YPD 平板，4℃保存。 四、电转化注意点： 1、感受态做好后，最后一次吸出 sorbital 时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。 2、最后用毛细管取出100ul 出来，加入质粒，混匀！（怕量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。 ） 3、电转杯清洁处理:一般先冲洗，洗净；然后浸泡在75%的乙醇中；使用前我们都是放在超净台上，开启紫外，边吹风晾干，边进行紫...