胚胎干细胞培养标准化操作规程

胚胎干细胞培养标准化操作规程 目录 一、细胞 二、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态 培养基 细胞复苏 冻存细胞 明胶包被 细胞传代 三、体外分化 培养基 包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片） 体外分化方法 四、移植细胞的准备 细胞 多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡 1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的 B5-ES 细胞。由 Dr. Nagy 的实验室制备。 2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了 17 代。 3．J1-由 Dr. Jaenish 的实验室友情提供。我们得到时大约传了 7－9 代。 4．J1rtTA-rtTA 表达 J1 细胞，由 Dr. Jaenish 的实验室友情提供。 5．表达黄色荧光蛋白的 YC5-ES 细胞，由 Dr. Nagy 的实验室提供。 一般培养--维持 ES 细胞处于未分化状态 ES 细胞培养用含有 ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有 0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每 2－3 天从达到 80％－90％融合的平板按1：8 的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板 2 个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于 37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。 培养基 ES: 配制一 20×不含 DMEM，HS，ESGRO 的溶液（该溶液也能用于 EB 培养基--见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为 2×，每管 42ml），贮存在-20℃。通过将21ml 该溶液，HS 和ESGRO 加入 450mlDMEM 中制备培养基，0.2μm 滤膜过滤。贮存于 4℃。 注：一瓶 DMEM 是 500ml。 贮存液 DMEM(高糖) 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST ESGRO 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。 步骤： 1．从液氮中取出一管细胞； 2．将冻存管置于37℃水浴中2 分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）； 3．将细胞转移到一15ml Falcon 管中； 4．加入 5ml ES 培养基（用培养基冲洗冻存管）； 5．离心 3 分钟； 6．弃上清，用 2ml ES 培养基重悬细胞，至少吹打 10 次； 7．接种在明胶包被（见下文）的6 孔或 6cm 组织培养皿； 8．孵育。 冻存细胞 冻存液 90％HS ...