腺病毒载体操作手册1407R2

腺病毒载体操作手册 1 腺病毒载体操作手册 一、实验流程 制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。 二、实验材料 （一）腺病毒载体、包装细胞和菌株 该 病毒包 装 系 统 为 两 质 粒 系 统 ， 组 成 为 穿 梭 质 粒 （ 包 括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒 pBHGlox （delta）E1,3Cre。其中穿梭质粒 pHBAd-CMV-IRES-GFP 和 pHBAd-U6-GFP 能表达绿色荧光蛋白（GFP）。pHBAd-CMV-IRES-RFP 和 pHBAd-U6-RFP 能表达红色荧光蛋白（RFP）。 腺病毒载体操作手册 2 1 、载体信息 1) 腺病毒克隆载体图谱如下： 各载体用途如下表： 腺病毒载体名称 干扰 pHBAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP 过表达 pHBAd-CMV-IRES-GFP, pHBAd-CMV-IRES-RFP 标记示踪 pHBAd-CMV-IRES-GFP, 1pHBAd-U6-GFP5118bpITRpSV40 Poly AAmppUC oriPrCM VGFPU6Lox P ITR[HindIIISalI( )( )( )( )( )( )NheI(1384)XbaI(456)EcoRI(742)BamHI(748)AgeI(731)SacISacIINsiINotINotINdeINdeINcoINcoI 1pHBAd-U6-RFP4993bpITRpSV40 Poly AAmppUC oriPrCM VRFPU6Lox P ITR( )( )( )( )( )( )NheI(1384)XbaI(456)EcoRI(742)BamHI(748)AgeI(731)AgeINsiISacIIHindIIISacI SaII NdeINdeINotINotI1pHBAd-MCMV-IRES-EGFP5322bpITRpSV40 Poly AAmppUC oriIRESrM CM VEGFP ITRLox PAgeIClaIEcoRI(1042) 1pHBAd-MCMV-RFP5337bpITRpSV40 Poly AAmppUC oriLox PrM CM VRFP ITRCMVEcoRIBglIISmaINsiINotIPstI PAgeIClaIBamHINheIPacINcoINdeI 腺病毒载体操作手册 3 pHBAd-CMV-IRES-RFP, pHBAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP 2） 骨架质粒信息如下： 2、细胞株 293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为 DMEM(含 10% FBS)。 3、菌株 大肠杆菌菌株 DH5α。用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。 三、包装细胞 293A 细胞的培养 （一） 293A 细胞的...