基因工程技术-笔记整理

基因工程技术：根据人们的愿望，进行严密的设计,通过体外 DNA 重组和转移等技术,有目的地改造生物种性,使现有物种在较短的时间内趋于完善,制造出新的生物类型.质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从 1—200kb 不等，为双链、共价闭合环状DNA 分子 cccDNA，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中,它具有自主的复制和转录系统。质粒 在 细 胞 内 的 复 制 一 般 有 二 种 ： 紧 密 控 制 型 （ stringent control ） 和 松 弛 控 制 型（relaxedcontrol）.前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子；后者在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝。质粒的不相容性：利用共同复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共存.从细胞中分离质粒 DNA 的方法都包括 3 个基本步骤：培育细菌使质粒扩增;收集和裂解细胞;分离和纯化质粒 DNA。溶菌酶:破坏菌体细胞壁；SDS 和 TritonX-100：使细胞膜裂解。染色体 DNA 通常用于构建基因组文库和 Southern 杂交等。基因组 DNA 的提取植物基因组 DNA 提取：提取缓冲液（Tris.Cl—保持 pH，EDTA，NaCl，SDS)，氯仿/戊 醇 / 乙 醇 溶 液 — 沉 淀 和 抽 提 DNA ， 异 丙 醇 — 沉 淀 DNA （ 提 染 色体）,TE（Tris。Cl,EDTA）--溶解 DNA，RNase—保存液，降解 RNA，NaAC-加盐，70％乙醇—漂洗.细菌基因组 DNA 提取：SDS，蛋白酶 K，氯仿：异戊醇（24：1）—— 沉淀 DNA，苯酚:氯仿：异戊醇（25:24：1）-- 抽提,70%乙醇—漂洗，TE,NaCl—调节离子强度，RNase A，CTAB/NaCl 溶液—CTAB——一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，异丙醇/无水乙醇-沉淀上清液.总 RNA 制备mRNA 的分子结构容易受到 RNA 酶的攻击反应而降解,加上 RNA 酶极为稳定而且广泛存在，因此，在提取过程中应严格防止 RNA 酶的污染并设法抑制其活性,这是实验成败的关键。仪器—玻璃器皿：200℃烘 2h，塑料器皿:DEPC 水液处理—所有器皿最后硅烷化处理。RNA 酶抑制剂：DEPC——强烈但不彻底，与氨水溶液混合会产生致癌物；异硫氰酸胍—-最有效，使 RNA 酶失活；其他--RNA 酶蛋白抑制剂(RNasin)SDS, 尿素等。细胞内总 RNA 制备方法：异硫氰酸胍热苯酚法、酚/SDS 法、Trizol 法.（均先将组织在液氮中研磨成粉末）异硫氰酸胍热苯酚法:异硫氰酸胍（GIT)与 β－巯...