蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤（待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提 total—RNA.2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。3、RT-PCR，KOD 酶扩增猎取目的基因 c DNA。4、双酶切，将 cDNA.克隆入 PET28/32 等表达载体。5、转化到 DH5α 感受态细菌中扩增，提质粒.6 、 将 质 粒 转 化 入 表 达 菌 株 ， 挑 菌 检 测 并 保 种 。 表 达 菌 株 如 Bl21 （ DE3) 、 Rosetta gami（DE3)、Bl21 codon(DE3)等。7、蛋白的诱导表达。1）将表达菌株在 3ml LB 培育基中摇至 OD=0。6 左右，加入 IPTG,浓度梯度从 25μM到 1m M。37 度诱导过夜(一般 3h 以上即有大量表达）。2)SDS—PAGE 电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的 50％以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带.3）将有表达的菌株 10%甘油保种，保存 1ml 左右就足够了,并记录 IPTG 浓度范围.甘油是用 0。22μm 过滤除菌的,储存浓度一般是 30％—60％，使用时自己计算用量.4）用上述 IPTG 浓度范围的最低值诱导 10ml 表达菌，18 度,低转速(140-180rpm），诱导过夜作为包涵体检测样品。注意:1.假如表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加 IPTG 之前的培育基中加入 1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。2.保种可以取一部分分成 50μl 一管,每次用一管,避开反复冻融.8、包涵体检测。方案见附件 29、如有上清表达,则扩大摇菌。1)取保种的表达菌株先摇 10ml,37 度，300rpm 摇至 OD>=1。5，约 5h 左右，视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。2）将上一步中的 8ml 加入 300ml 培育基中 37 度,250rpm 摇至 OD= 1.0 左右(约2。5h～3h)，然后加 IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。)注:菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是，将手指放在瓶底晃动 ,看不清手指为宜,不过此法宜受气泡影响。3）过夜摇菌,使用包涵体检测的温度（18°左右)，转速 140rpm 左右.4）将菌液 6000rpm,4min，4 度离心收集菌体。加入 20mM PBS，洗一遍后用平衡缓冲液重悬。每 250ml 菌液用 30 ml 到 50ml 平衡缓冲液,视菌液的浓度而定。可用 4 支 50ml的离心管同时离心，但是,离心管要重复使用，用完后洗净...