包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤 1、包涵体的洗涤问题 通常的洗涤方法一般是洗不洁净的，我以前是这么做的，先把包涵体用 6M 盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到 4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。 包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。 此外刚处理完的包涵体好溶解。冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。假如说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。 2、如何得到比较纯的包涵体 对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。 包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。洗涤常用 1%以下的中性去垢剂，如 Tween、Triton、Lubel 和 NP40 等加EDTA 和还原剂 2-巯基糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加 50 mM NaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达 50%以上，而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液 pH 以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为 0.1-5mM。EDTA 为 0.1-0.3 mM。去垢剂如 Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白 Omp T(37 KDa)在 4-8mol/L 尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。 对于尿素和盐酸胍的选择： 尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素 8-10M，盐酸胍 6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为 70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以与溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采纳。 盐酸胍溶解能力达 95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性...
