分子生物学实验技术实验内容概要

2006DDDDDDDDDDDDDDDDDDRT-PCRDDDDRNADDD□□□□□每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。□□□□□1、将 100 卩 1 液体样品加入 1.5mlEp 管中，再加入 900 卩 1 冰预冷的 LS-BiotragentsTM(苯酚和异硫氰酸胍的混合物)。2、将样品剧烈混合后，在室温放置 5min。3、加入 200 卩 1 氯仿，颠倒 Ep 管混和两次，并剧烈振荡混和 10s。4、在 4°C 条件下，以 10000xg 离心 15min。5、将上层水相转移到一个新的 Ep 管中，加入等体积的异丙醇(Isopropanol)并混匀，然后在 4C 放置至少 10min。6、在 4C 条件下，以 10000xg 离心 15min 后，小心并尽可能地去除全部上清夜。7、用 1ml75%乙醇洗涤 RNA 沉淀和管壁。8、将 RNA 沉淀进行干燥(不能完全干燥)处理后，用 10 卩 1 无 RNase 污染的水(RNase-FreeWater)将 RNA 溶解并于-20C 保存。□□□□□1、所有的玻璃器皿均应在使用前于 180C 的高温下干烤 6hr 或更长时间。2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用 0.1%DEPC 水浸泡过夜。3、配制的溶液应尽可能用 0.1%DEPC，在 37C 处理 12hr 以上。然后用高压灭菌除去残留的 DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用 DEPC 处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22pm 滤膜过滤除菌。4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。DDDDDD□□□□□每人做一管。□20 卩 1 叮按下列顺序加5xBuffer4卩dNTPs6卩RNA 酶抑制剂1卩Oligo(dT)1卩随机引物1卩反转录酶 AMV1卩提取的 RNA6卩总体积20^1□□□□□42°C1h□□□□□1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。如在一般的 PCR 反应体系中，应先加水、Buffer、dNTPs、引物，最后加酶和模板。2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。4、酶类试剂应放置在冰盒上取用，用完后立即放回-20C，以防酶失活。DDDPCR□□□□□每人做一管。□□□□□50 卩 1 叮按下列顺序加样ddH2O32・7yl10xPCRBuffer5pdNTPs4pP12pP22pTaq0.3 卩 1cDNAtemplate4pTotal50yI□□□□□预变性94°C2min变性94°C30s退火50C45s延伸72C1min30cycles终延伸72C10minPCR 叮叮叮琼脂糖凝胶电泳1、电泳缓冲液 TBE(IOX)的配制：称取 Tris-base54g，硼酸 27.5g，并加入 0.5MEDTA(pH8.O)20ml,定溶至 1000...