蛋白提取方法

1 材料和方法1.1 材料1.1.1 组织和细胞的来源：1.1.2 仪器设备 机械组织匀浆器 低温高速离心机 (>40,000 g) 超速离心机 超生细胞破裂仪 超纯水装置1.1.3 试剂 三氯醋酸 (TCA) 丙酮 二硫苏糖醇 (DTT) 尿素CHAPS PMSF EDTA 乙醇 磷酸考马斯亮蓝 R350 抑肽素 A 亮肽素试剂纯度均应是分析纯或以上。1.1.4 溶液配制(1) PBS ：NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4，溶于 800 ml 水中，用 HCl 调 pH 至 7.4，用纯水定容至 1 L ；(2) EDTA 储存液：18.61 g Na2EDTA•2H2O，溶于 70 ml 纯水中，用 10 mol/L NaOH 调节 pH 值至 8.0 (约需 2 g NaOH 颗粒)，定容为 100 ml。可高压灭 菌后分装备用；(3) 亮肽素储存液 (50 μg/ml，100×) 10 mg/ml 溶于水，-75℃保存；使用时配成 50 μg/ml 储液，-20℃ 保存；(4) 抑肽素储存液 (70 μg/ml，100×) 1 mg/ml 溶于甲醇，-75℃保存；使用时配成 70 μg/ml 储液，-20℃ 保存；(5) PMSF 储存液 (10 mM, 100×): 17.4 mg PMSF，溶于 1ml 异丙醇中，-20℃ 保存。DTT 储存液 (1 M): 0.31 g DTT 溶于 2 ml H2O 中，-20℃ 保存 (DTT 或含有 DTT 的溶液不能进行高压处理，可过滤除菌) 。(7) 裂解液: Lysis buffer A (9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Lysis buffer B(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) Lysis buffer C 40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2OLysis buffer D(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)Lysis buffer E (5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Lysis buffer F100 μL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v glycerol)●CA、蛋白酶抑制剂混合物和 DTT 在临用前加入。蛋白酶抑制剂混合物[3] 成分 终浓度蛋白酶抑制剂混合物 PMSF 35 μg/ml or 1 mM EDTA 0.3 mg/ml (1 mM) 抑肽素 0.7 μg/ml 亮肽素 0.5 μg/ml1.2 方法1.1.1 组织蛋白提取方法1.2.1.1 三氯醋酸/丙酮沉...