１。双抗体夹心法 双抗体夹心法,属于非竞争结合测定、它就是检测抗原最常用得 ELISA,适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇得多价抗原,而不能用于小分子半抗原得检测。其基本工作原理就是:利用连接于固相载体上得抗体与酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合,形成固相抗体—抗原－酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体与酶标抗体得量相对于待测抗原就是过量得,因此复合物得形成量与待测抗原得含量成正比(在方法可检测范围内)、测定复合物中得酶作用于加入得底物后生成得有色物质量(O Ｄ值),即可确定待测抗原含量、 若固相载体上得抗体与酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不同得抗原决定簇结合,则属于双位点夹心法。若采纳固相载体上得抗原与酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合,则就是双抗原夹心法、操作步骤:⑴ 将特异性抗体包被固相载体 M ｃ Ab。孵育一定时间,使形成固相抗体,洗涤除去未结合得抗体与杂质。⑵ 加待检标本,孵育,使标本中得抗原与固相载体上得抗体充分反应,形成固相抗原抗体复合物、洗涤除去其她未结合物质。⑶ 加酶标抗体,孵育,使形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体夹心复合物。洗涤除去未结合酶标抗体。 ⑷ 加底物显色。固相上得酶催化底物产生有色产物,通过比色,测标本中抗原得量、现多采纳针对单一抗原决定簇特异性得单克隆抗体做固相化与酶标抗体,则受检样品与酶标抗体可一次性加入,简化流程,缩短反应时间、若标本中待测抗原浓度过高,抗原可分别与酶标抗体与固相抗体结合而不形成上述夹心复合物(类似于免疫沉淀反应中抗原过剩时得后带现象),使最终结果低于实际含量(钩状效应),甚至出现假阴性现象。因此对此类标本应适当稀释后再测定。另外,当血清中存在类风湿因子(RF)时,类风湿因子(RF)可充当抗原,而形成固相抗体—类风湿因子－酶标抗体夹心复合物,从而出现假阳性结果、２。间接法 此法就是测定抗体最常用得方法,属非竞争结合试验、其原理就是将抗原连接到固相载体上,样品中待测抗体与之结合成固相抗原—受检抗体复合物,再用酶标二抗(针对受检抗体得抗体,如羊抗人 IgG 抗体)与固相免疫复合物中得抗体结合,形成固相抗原-受检抗体—酶标二抗复合物,测定加底物后得显色程度,确定待测抗体含量。操作步骤⑴ 将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原。洗涤除去未结合得抗原及杂质。⑵ 封闭:用高浓度无关蛋白封闭,阻止待检血清中非特异Ｉ g Ｇ吸附固相。⑶ 加待检血清,孵育,使...
