《医学生物化学实验》教案第 1 次课 2 学时实验项目 3，5-二硝基水杨酸法（DNS 法）测定还原糖 实验性质设计性实验教学目的和要求1、了解糖的还原性2、掌握还原糖定量测定的原理和方法。3、熟悉分光光度计的使用方法。教学重点与难点重点:绘制标准曲线的方法，分光光度计的使用原理和使用方法。难点：标准曲线的应用。实验材料1.试剂（1）1mg/mL 葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖 100mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至 100mL，即含葡萄糖为 1.0mg/mL。（2）3，5-二硝基水杨酸试剂：称取 6.3 g 3，5-二硝基水杨酸并量取 262 mL 2mol/L NaOH 加到酒石酸钾纳的热溶液中（182 g 酒石酸钾纳溶于 500 mL 水中），再加 5 g 结晶酚和 5 g 亚硫酸氢钠溶于其中，搅拌溶解，冷却后定容到 1000 mL 贮于棕色瓶中。（3）未知浓度还原糖。2.材料 小麦淀粉或玉米淀粉。3.器材 分光光度计，天平，水浴锅，电炉，试管若干等。实验内容一、实验原理★：在 NaOH 和丙三醇存在下，3，5-二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的 NaOH 碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm 波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。黄色 桔红色二、实验步骤：1.取 7 支具塞刻度试管编号，按表 1 分别加入浓度为 1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和 DNS 试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应液。表 1 葡萄糖标准曲线制作管 号1mg/ml 葡萄糖标准液(mL)蒸馏水(mL)DNS(mL)葡 萄 糖 含量(mg)光密度值(OD-540nm)100.50.5020.10.40.50.130.20.30.50.240.30.20.50.350.40.10.50.460.500.50.57（未知浓度还原糖）0.500.50.5将各管摇匀，在沸水浴中准确加热 5min 取出，冷却至室温，用蒸馏水补足至5mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长 540nm，用 1 号管调零点，分别测出 2~6 号管的光密度值。2.绘制标曲▲以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量(mg)为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线（电脑Excel 完成最好）。计算 7 号管还原糖的百分含量。三、结果与计算▲：计算出 7 号管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。 查曲线所得葡萄糖毫克数×提取液总体积/测定时取用体积还原糖(%) =——————————————————————————×100...
