蛋白提取方法

ﻫ1 材料与方法 1、1 材料 1、1、１ 组织与细胞得来源: ﻫ１。1、2 仪器设备 ﻫ机械组织匀浆器 ﻫ低温高速离心机 (＞40,０ 0 ０ g) 超速离心机 ﻫ超生细胞破裂仪 超纯水装置 ﻫﻫ1、1。3 试剂 三氯醋酸 (TC Ａ) 丙酮 二硫苏糖醇 (D Ｔ T) ﻫ尿素 ﻫC Ｈ A Ｐ S ﻫPMSF ﻫEDTA ﻫ乙醇 ﻫ磷酸 考马斯亮蓝Ｒ 3 ５ 0 ﻫ抑肽素Ａ ﻫ亮肽素 试剂纯度均应就是分析纯或以上。ﻫ1。１、４ 溶液配制 ﻫ)1( PBS: ﻫN ａ Cl ８ g, KCl 0、2 g, Na ２ HP Ｏ 4 1。44 g, Ｋ H2PO4,溶于 800 ml 水中,用 HCl 调 p Ｈ至 7.4,用纯水定容至 1 L; ﻫ)2( Ｅ DTA 储存液: 18.61 g Na2EDTA•2 Ｈ２ O,溶于 70 ml 纯水中,用 10 mol/L NaOH 调节ｐ H 值至 8.0 (约需 2 g ＮａＯ H 颗粒),定容为 100 ml、可高压灭菌后分装备用; ﻫ)３( 亮肽素储存液 (50 μg/ｍ l,100×) １ 0 m ｇ/ml 溶于水,-75℃保存;使用时配成 50 μg/ｍ l 储液,-２ 0℃保存; (4) 抑肽素储存液 (7 ０ μg／ml,10 ０×) 1 mg／ｍ l 溶于甲醇,—75℃保存;使用时配成７ 0 μg/ml 储液,-2 ０℃保存; (5) P ＭＳＦ储存液 (１０ ｍ M, 100×): １７.4 m ｇ PM Ｓ F,溶于１ ml 异丙醇中,—２ 0℃ 保存。 ﻫＤ TT 储存液 (1 M): ﻫ０。31 ｇ DTT 溶于 2 ｍ l Ｈ 2O 中,-20℃ 保存 (DTT 或含有 DTT 得溶液不能进行高压处理,可过滤除菌)。 ﻫ)7( 裂解液: Lysis buf ｆｅ r Ａ (９ M ｕｒ e ａ, ４% ｗ/v ＣＨ A Ｐ S, 1％ w／v DTT, ０.5％ CA and a c ｏｃ ktai ｌ of ｐｒ ote ａｓｅ inhibit ｏ rs)ﻫﻫLys ｉ s buffer B(7 M ur ｅ a, 2 M ｔ hi ｏ u ｒ ea, 4% w/v Ｃ H ＡＰ S, 1％ w／v DTT, ０、５% CA ａ n ｄ ａ cocktai ｌ o ｆ ｐ rote ａ se inh ｉbitors) ﻫLys ｉｓ b ｕｆｆ er C 40 ｍＭ Tr ｉ s－base (ｐ H 9。5) i ｎ ｕ ltrap ｕｒ e H2OＬ y ｓ is buffer D(8 Ｍ ur ｅ a, 4％ CH ＡＰ S, 4 ０ mM Tris(ｂ as ｅ), 40 ml)ﻫLy ｓｉ s buffer E ﻫ(５ M urea, 2 M t ｈ io ｕ re ａ, 2％ SB 3-10, 2％ CHAPS, １% w/v DTT, 0、５% C Ａ and ａ cockt ａｉ...