gfp基因的克隆与表达

gfp 基因的克隆与表达(19页)Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。 基因工程实验设计 题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达 专业：生工 1001 姓名：刘会淼 2025 年 3 月 13 实验目的：讨论绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 实验方法; 通过分别将 DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒 pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α 感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸内切酶 Not I 与 Bam H1 和 PCR 对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体 BL-21 内进行表达，再用 IPTG 诱导 GFP 基因表达，假如可以看到显现绿色，推断 GFP 基因在大肠杆菌中成功表达。 1.材料与方法：1.1.1 实验材料克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性内切酶 Bam H1、 Not Ⅰ1.1.2 仪器设备Eppendof 离心机、电泳仪 、电子天平 、台式离心机 、控温磁力搅拌器、调温电热套pH 计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器 、紫外灯、生物洁净工作台 、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培育皿、、移液枪、枪头 、接种环 、酒精棉球 、灭菌枪头 、平板封口膜、离心管 1.1.3 试剂及溶液 分装后于121 ℃ 高压灭菌20 min。（LB固体培育基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）；溶液Ⅰ 50 mL葡萄糖 50 mmol/LTris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/L EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L121℃高压灭菌 15 min后置于0~4℃贮存；溶液Ⅱ 100 mLNaOH 0.2 mol/LSDS 1% (W/V)用时由母液2 mol/L NaOH、10%(W/V) SDS稀释现配；溶液Ⅲ 100 mLKOAc (5 mol/L) 60 mL冰乙酸 11.5 mLH2O 28.5 mL 121 ℃高压灭菌 15 min后置于0~4 ℃贮存；氯仿；琼脂糖；灭菌的去离子水；10×酶切缓冲液；TaqDNA聚合酶；TaqDNA聚合酶缓冲。灭菌的0.1 mol/L CaCl2，标准相对分子质量的DNA；溴乙锭（EB）储存液 0.5 µg/mL；LB/Kan（50 µg/mL）固体培育基；IPTG配成浓度为400 mM水溶液，-20 ℃保存备用；卡那霉素（Kan）配成浓度为100 ug/mL水溶液，-20 ℃保存备用；70%乙醇：用新开装的乙醇和灭菌无离子水配成，放在0~4 ℃；无水乙醇 ：放在0~4 ℃；RNase 母液：将RNase ...