分子克隆——主要步骤(2页)Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。笔记 3（分子克隆 2——主要步骤）分子克隆可以分为以下几个步骤： （1）带有目的基因的 DNA 片段的获得 （2）重组 DNA 分子的构建 （3）重组 DNA 分子的转化和重组克隆的筛选 （4）特定重组克隆的鉴别分离制备待克隆的 DNA 片段————将靶 DNA 片段与载体在体外进行连接————重组 DNA 分子转入宿主细胞————筛选、鉴定阳性重组子————重组子的扩增。1.带有目的基因的 DNA 片段的获得：可以用限制内切酶降解基因组 DNA ，再配合使用其他实验手段得到待定的DNA 片段，可以用超速离心的方法分离出具有特定核苷酸组成的 DNA 片段 ，可以用 mRNA 做模板，用反转录酶合成互补 DNA ，即 cDNA ，也可以用化学合成的方法直接合成一段 DNA 。 2.重组 DNA 分子的构建：重组 DNA 分子中包括两部分，一部分是外源 DNA ，即目的 DNA 片段 ，另一部分是载体 DNA 。用作载体的，有质粒、噬菌体或病毒 DNA。它们的基本特征是能够独立复制。假如用同一种限制性内切酶切割这两种 DNA，则它们的末端完全相同，由于有互补的单链末端序列存在，在连接酶的作用下，就可以形成重组 DNA 分子。在没有互补单链末端的情况下，也可以用酶学方法造成一个互补单链末端之后再进行连接。 3.重组 DNA 分子的转化和重组克隆的筛选：重组 DNA 分子必须进入宿主细胞中，才能得到扩增和表达．这个过程叫做转化。大肠杆菌是目前使用最广泛的宿主细胞。除此以外．其他细菌、酵母、哺乳动物细胞等也可作为宿主细胞，可以根据实验的需要加以选择。在被转化的宿主细胞中，不同的单个细胞(在平板上表现为单个菌落，亦称克隆)中可能含有不同的重组质粒或非重组质粒，因此必须进行筛选，以便确定哪些是重组克隆。筛选可以使用抗菌素抗性或其他方法，依载体的性质而定。 4.特定重组克隆的鉴别：由于重组克隆往往是较多的，而在某一克隆实验中，我们感兴趣的目的克隆只有一个或几个，所以需要进一步鉴别。使用的方法主要有核酸杂交法和免疫化学法。 此外，找出了目的克隆之后，还需要根据实验的目的，进一步弄清目的克隆中外源 DNA 片段上的基因的结构和功能。 主要有酶切图谱的制定，基因在DNA 片段上的精确定位，确定是否有内含子，DNA 序列分析，离体翻译实验，外源基因在某些宿主细胞中的表达及产物的提纯等。 、》·*\—…、{;`!~~【[:|—[…。，*（】！，"]
