2025 级讨论生《植物科学实验技术》双向电泳技术（524 lab）一、实验目的：了解蛋白质组学讨论中的基本实验设计思绪，掌握蛋白质组双向电泳实验流程及相关软件分析。二、材料与试剂材料：①叶片（墨兰、石斛）②花芽（春石斛、蝴蝶兰）③蝴蝶兰花瓣（白色、红色）④蝴蝶兰花苞 仪器：聚焦仪，天平，电子秤，合用于 2ml、10ml、50ml 离心管的高速离心机，PH 计，磁力搅拌器，低温冰箱，真空泵，紫外分光光度计，水浴锅等 试剂：三氯乙酸（TCA），丙酮，β-巯基乙醇，Tris-base，牛血清蛋白，考马斯亮蓝 G-250，无水乙醇，尿素（Urea），硫脲（Thiourea）,CHAPS，DTT，碘乙酰胺 IAA，IPG buffer，PH3-10,IPG 预制胶条（7cm，PH3-10），丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，SDS，过硫酸铵(Ap),甘氨酸 Gly，硫酸铵，甲醇，溴酚蓝，超纯水，液氮,正磷酸等 器皿：研钵，10ml、50ml、100ml、500ml 容量瓶，10ml、500ml 烧杯，1.5ml、50ml 离心管， 50ml 量筒，1ml、5ml、2.5ul、10ul、20ul、100ul 微量移液器，100ml 棕色瓶，冰盒，滤纸，玻璃棒，记号笔，布氏漏斗，试管等三、实验流程I 样品制备A：蛋白质制备方法（全程低温，操作尽量快、准；双向电泳最重要、最基础环节）A-1 TCA/丙酮沉淀法 —— 墨兰、石斛叶片1. 称取 0.3 克左右样品，在预冷的研钵中，液氮研磨成粉2. 粉末转移至 10ml 离心管中，加入 6-8ml 10%TCA/丙酮，-20℃沉淀过夜（至少 2 小时），震荡几次3. 取沉淀过夜的样品重量平衡，离心（13200rpm、4℃、30min），弃上清4. 向沉淀中加入 6-8ml 冷丙酮，混匀并进行重量平衡，-20℃沉淀 20min,离心（13200rpm、4℃、30min）弃上清。（此过程反复三次）5. 向沉淀中加 6-8ml 80%冷丙酮混匀并进行天平平衡，-20℃沉淀 20min,然后离心（13200rpm、4℃、30min），弃上清。（此过程反复两次）6. 转移沉淀到 1.5ml 离心管中，加 1ml 冷丙酮洗涤、沉淀两次（离心 0.5min）7. 真空冰浴抽滤，干燥沉淀至干粉，-80℃低温保存。(补充：醋酸铵/甲醇沉淀法:基本环节同 TCA/丙酮沉淀法，只是第 2 步加入的是 0.1M 醋酸铵/甲醇)A-2 酚抽提法 —— 石斛、蝴蝶兰花芽1. 称取 0.3 克左右样品，在预冷的研钵中，液氮研磨成粉2. 粉末转移至 10ml 离心管中，加入酚抽提液与水饱和酚混匀，离心（13200rpm、4℃、20min）3. 吸取上层酚相，加入 0.1M 醋酸铵甲醇（①液），剩余下层水相，加入 Tris 饱...
