人胰岛素得制备一、 获得目得基因从供体细胞中提取 mRNA,以其为模板,在反转录酶得作用下,反转录合成胰岛素 mRNA 互补 DNA,再以 cDNA 第一链为模板,在反转录酶或 DNA 聚合酶 I 得作用在,最终合成编码它得双链 DNA 序列。即得到了目得基因。反转录-聚合酶链反应法(一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录得 mRNA1, 细胞总 RNA 得提取 :取胰岛 B 细胞,用 PBS 洗后,加入 TRIZOL 试将细胞破裂,后用 DEPC 处理,多次离心后,取 RNA 白色沉淀,测 OD 值,电泳。2 ,从总 RNA 中分离 mRNA:取上述提取得总 RNA 若干,加入 Buffer OBB ,Oligotex Suspension ,打匀。 70℃水浴(裂解 RNA 得二级结构), 20-30℃条件下,静置(让 Oligotex 与 mRNA结合)。 将 Oligotex/mRNA 复合物得沉淀加到 EP 管 SPIN 柱上高速离心,加Buffer 将其她 RNA 洗脱,最后用琼脂糖凝胶电泳纯化 mRNA。(二)mRNA 转录合成 cDNA 第一链cone 第一链得合成 加入上步获得得 mRNA 与适当引物于 EP 管中,加入 RNase-free water,混匀后,70℃反应 10 分钟,反应完成后,立即将反应体系置于冰上 5min;略微离心一下,顺序加入缓冲液、 RNA 酶抑制剂、反转录酶、 dNTP(加入放射性同位素利于检验), 混匀,略微离心反应物之后,42℃放置 2 分钟。取出置于冰上。电泳分析,同位素活性测定。(三)PCR 法扩增,特异合成目得 cDNA 链通过胰岛素得特异引物,用 PCR 法进行扩增,特异得合成胰岛素得 cDNA 链 。PCR 法得操作步骤:预变性引物退火引物延伸循环 25-35 次最后延伸前端引物:5’-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt cac cac cac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3’后端引物:5’-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc cag ctg gta-3’二、 组建重组质粒采纳 pQE--30 质粒作为载体,用双酶切法进行基因重组。１、双酶切法 用两种酶限制性内切核酸酸消化载体 DNA 与外源 DNA 片段,使载体与外源目得基因得两端分别形成不同黏性末端,将它们混合,在连接酶得作用下相同得黏性末端可退火连接成重组 DNA 分子,从而实现 DNA 得定向连接。２、重组过程pQE--30 用 Hind Ⅲ 与 BamHⅠ 酶切,琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片段。外源 DNA 片段同样也用 Hind Ⅲ 与 BamHⅠ 酶切并回收纯化酶切片段。双酶切后得载体外源...
