基因工程实验教学方案湖南人文科技学院生命科学系生物技术教研室实验一 重组质粒的提取及转化表达型菌株 Ⅰ 质粒 DNA 的提取实验目的 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术与方法。实验原理1．碱变性法基本原理是，在 Ph12.0-12.6 碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体 DNA 变性，而共价闭环质粒 DNA 仍为自然状态。将 PH 调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体 DNA 之间交联形成不溶性网状结构大部分 DNA和蛋白质在去污剂 SDS 的作用下形成沉淀，而质粒 DNA 仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片，染色体 DNA，RNA 及蛋白质，质粒 DNA 尚在上清中，再用酚氯仿或硅基质膜柱子进一步纯化 DNA。2．设计构建体外重组 DNA 分子构建体外重组 DNA 分子，首先要了解目的基因的酶切图谱。选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有识别位点，也就是说用一种或两种限制性内切酶就能切割得到完整的外源 DNA 基因。构建体外重组 DNA 分子，最简单的重组方式就是在目的基因 DNA 的两端用两种不同的限制性内切酶进行酶解，产生两个不同的粘性末端。再用这两种限制性内切酶去选择合适的载体进行酶切，也产生这两个不同的粘性末端，这样构建的重组 DNA 分子，目的基因 DNA 片段是从一个方向插入质粒载体中的，重组的效率高，也易于筛选处重组子。附表达载体 pGEX-6P-1-mreB 的构建图：仪器材料与试剂（一）仪器1．恒温摇床 2．台式离心机3．漩涡混合仪（二）材料与试剂1．含 pGEX-6P-1-mreB 质粒的大肠杆菌 DH5α2． 含 pGEX-6P-1 质粒的大肠杆菌 DH5α3．液体 LB 培育基4．100mg/mL 氨苄青霉素 Amp5．新捷质粒提取试剂盒实验步骤分为两组：一组提取质粒 pGEX-6P-1-mreB，另一组提取质粒 pGEX-6P-1。1）12000rmp 离心 30 秒收集 1-5ml 过夜培育的细菌，弃尽培育基。加入 250ul已加入 Rnase A 的 Buffer Ⅰ, 充分悬浮细菌沉淀。2）加入 250ul Buffer Ⅱ, 温柔并充分地翻转离心管 4-6 次。3）加入 350ul Buffer Ⅲ,温柔并充分地翻转离心管 4-6 次。4）13000 rmp 离心 10 分钟。5）将核酸纯化柱置于 2ml 离心管中，转移步骤 4 中的上清液到核酸纯化柱中，盖上管盖，12000rmp 离心 30 秒。6）弃 2ml 离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到 2ml 离心管中，在核酸纯化柱中加入 700ul Buffer W2,盖上管盖，12000rmp 离心 30 秒。7）弃 2ml 离心管...
