实时定量 PCR 引物和探针设计操作步骤 Primer Express 软件Primer Express 是实时定量 PCR 引物和探针设计的专用软件。遵守以下三个原则有助于快速建立定量 PCR 反应体系：1.所有扩增根据同样的原则设计 (Primer Express)；2.所有 PCR 反应在 ABI PRISM ?7000/7900 上使用同样的热循环条件；3.所有反应使用相同的 PCR 试剂。引物和探针的设计原则下述原则的重要程度由上往下越来越低，请尽量满足编号靠前的条件。它们中有的已经在 Primer Expre 软件中设置成缺省值，有的则需要在选择引物和探针时由设计者加以运用。假如是设计SYBRGreen 引物，也要选择 TaqMan Primer and Probe design 并遵守这些规则，但是只需要合成引物就可以了。TaqMan 探针：1. 保持 G-C 含量在 30-80%之间。2. 避开同一碱基重复过多。特别是 G，不可超过 4 个及以上。3. 5' end 不能是 G。4. 尽量使探针中的 Cs 多于 Gs。假如不能满足，则使用互补链上的探针。5. 对于单探针反应，用 Primer Express?软件计算出来的 Tm 值应当在 68-70 °C 之间。引物：1. 在探针确定以后再选择引物。2. 引物要尽可能地接近探针，但是不要重叠。3. 保持 G-C 含量在 30-80%之间。4. 避开同一碱基重复过多。特别是 G，不可超过 4 个及以上。5. 用 Primer Express?软件计算出来的 Tm 值应当在 58-60 °C 之间。6. 3' end 的 5 个碱基中 G and/or C 碱基的总数不能超过 2 个。实时 TaqMan 引物和探针设计Begin by opening Primer Express and selecting "File", "New", and "TaqMan? Primer & Probe Design". The following screen will appear. You can close the TaqMan? Primer & Probe Data box as shown.输入或插入序列 Import or paste a sequence into the window (Import shown). To paste a sequence from a Word or text file, first copy it to the clipboard. Be sure to only select the sequence (including numbers or annotations is OK); do not include extraneous information such as accession numbers etc. Next, select "Edit" and "Paste". The sequence will appear in the Sequence screen of Primer Express. Or, to Import a Sequence, click the "Import DNA...
