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琼脂糖电泳步骤

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 带电物质在电场中的趋向运动称为电泳。凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点,已成为蛋白质、核酸讨论的首选标准方法 泳动率是带电颗粒在一定的电场强度下,单位时间内在介质中的迁移距离。泳动率与样品分子所带的电荷密度、电场中的电压及电流成正比,与样品的分子大小、介质黏度及电阻成反比。不同大小的带电分子具有不同的泳动率,在不同的介质条件下又具有不同的分辨效率 影响泳动率的因素包括样品的物理性状、支持物介质、电场强度和缓冲液离子强度 DNA 的凝胶电泳常使用两种支持介质:琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应 在碱性缓冲液中 DNA 分子带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动 在一定的电场强度下,DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应,即 DNA 分子本身的大小和构型 琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的 DNA,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的 DNA 分子 可以分离长度为 100bp 至近 60kb 的 DNA 分子,常采纳 TAE、TBE 和 TPE 三种缓冲体系 EB:即溴化乙锭,它能够插入 DNA 分子中的碱基对之间而与 DNA 结合。由于 EB 分子的插入,在紫外光的照射下,凝胶电泳中的 DNA 条带呈现出红色荧光,易于检测。可以检测 10ng 的 DNA 注意:EB 是一种诱变剂,操作时一定要注意安全,必须戴塑料或乳胶手套琼脂糖核酸电泳的步骤1.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗洁净,放在制胶平板上,封闭模具边缘,架好梳子;2.根据欲分离 DNA 片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶:准确称量琼脂糖干粉,加入到配胶用的三角烧瓶内,定量加入电泳缓冲液;常见的有如下表的琼脂糖浓度(质量体积比 1.0%即每 100ml 0.5X TBE 中加入1g 琼脂糖)3.放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻,加入 EB(5μl/100ml),轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液,倒入电泳槽中,待其凝固;4.室温下 30~45 分钟后凝胶完全凝聚,小心拔出梳子,将凝胶安放在电泳槽内;5.向电泳槽中倒入电泳缓冲液,其量以没过胶面 1mm 为宜,如样品孔内有气泡,应设法除去;6.在 DNA 样品中加入 10×体积的载样缓冲液...

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