03-逆转录-聚合酶链反应

逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的 mRNA 作为模板，采纳 Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR 使 RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA 样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、猎取目的基因、合成cDNA 探针、构建 RNA 高效转录系统。详细 实验方法逆转录-聚合酶链反应实验方法 实验材料组织或细胞样品试剂、试剂盒RNA 提取试剂dNTP 混合物Taq DNA 聚合酶第一链 cDNA 合成试剂盒仪器、耗材离心管离心机水浴锅PCR 管电泳仪凝胶图像分析系统逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的 mRNA 作为模板，采纳 Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR 使 RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA 样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、猎取目的基因、合成cDNA 探针、构建 RNA 高效转录系统。一、反转录酶的选择1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA 酶 H 活性相对较弱。最适作用温度为 37℃。2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和 RNA 酶 H 活性。最适作用温度为 42℃。3．Thermus thermophilus、Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录 RNA，以消除 RNA 模板的二级结构。4．MMLV 反转录酶的 RNase H-突变体：商品名为 Superscript 和 SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的 RNA 转换成 cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的 mRNA 模板合成较长 cDNA。二、合成 cDNA 引物的选择1． 随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采纳随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA。用此种方法时，体系中所有 RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中给予所需要的特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 ...