在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时,需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(d ｏ u ｂｌ e ｉ mm ｕ nof ｌ u ｏｒ escen ｃ e lab ｅ ling ｍｅ th ｏ d）也分为直接法与间接法。(１）直接法双重免疫荧光标记:将标记有两种不同荧光素得抗体（如抗A 与抗 B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合得荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应得激发滤片观察,即可对两种抗原进行定位与定量。直接法简便可靠，但灵敏度较低。ﻫ(2(间接法双重免疫荧光标记:用未标记得两种特异性第一抗体孵育组织或细胞,洗去多余得第一抗体后，再用两种不同得荧光素分别标记得第二抗体孵育组织或细胞,洗去多余得第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应得激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位与定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体得种属必须与第一抗体得种属相匹配。免疫荧光双标技术中操作要点与注意事项ﻫ一、免疫荧光技术中标本制作得基本程序近似于酶免疫组化,不同点如下：ﻫ 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭与一抗孵育与其相同. 2、免疫荧光得二抗使用不同荧光标记得二抗孵育，孵育时间根据抗体得工作浓度确定．ﻫ ３、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片与观察。 4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0、01 Ｍ PBS (1:１）。条件许可,建议购买抗淬灭得封片液，使标本可以保存更久。 5、荧光抗体得孵育以及后续处理需要避光。ﻫ 6、荧光抗体染色假阳性可能会多,需要分别设定阳性与阴性对比。ﻫ二、注意事项ﻫ １、荧光染色后一般在１ h 内完成观察,或于 4℃保存４ｈ,时间过长，可能会使荧光提前衰退。 2、每次试验均需设置以下三种对比: (1( 阳性对比:阳性血清+荧光标记物;ﻫ ）2( 阴性对比：阴性血清+荧光标记物；ﻫ ( 3( 荧光标记物对比:PB Ｓ＋荧光标记物.三、免疫荧光双标得经验之谈ﻫ 1、选取一抗时，要求来源于两种不同得动物,我用得就是来源于家兔与大鼠得抗体,二抗则就是不同荧光信号标记得，我用得就是 donke ｙ ａ n ｔｉ—r ａｂ bit—FITC(绿(与 d ｏnkey an ｔ i—ra ｔ—Tex—R ｅ d(红(。ﻫ ２、我得做法就是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗 4℃孵育过夜比较好,背景比较清楚.ﻫ 3、我得阳性对比采纳得就是阳性组织切片，阴性对比则...
