植物原生质体的制备及融合卢文

原生质体的制备及融合生 31 卢文2025012377一、实验目的：a)学习植物原生质体的分离制备技术，观察原生质体形态。b)学习植物原生质体的融合技术，观察融合原生质体时其形态及变化。二、实验原理：详见讨论。三、实验用品：显微镜、擦镜纸、剪子、镊子、小平皿、吸管、直式漏斗、300 目尼龙网、10ml 离心管、载玻片、盖玻片。四、试剂：a)洗涤液：甘露醇0.6MCaCl2·2H2O8mMNaH2PO4·H2O2mMpH=5.6b)酶混合液：纤维素酶1% 果胶酶0.5-0.7% 甘露醇0.6M CaCl2·2H2O8mM NaH2PO4·H2O7mM MES3mM pH=5.6c)PEG 溶液：PEG-600040% CaCl2·2H2O3.5mMKH2PO4·H2O0.7mM 葡萄糖0.3mM pH=5.8d)高 Ca，高 pH 洗涤液： CaCl2·2H2O100mM Tris50mM 山梨醇100mM pH=10.5e)蔗糖溶液：20%五、实验步骤：a)原生体的制备i.将新奇花瓣用蒸馏水洗洁净，用滤纸吸干表面水分。ii.用尖头镊剥去木料的下表皮或将其剪成小细条，加入几滴酶液恒温振荡半小时。iii.酶解好的原生质体混合液经 300 目尼龙网过滤到 10ml 离心管，加入少量洗涤液定容至 4ml，此时，未被酶解的大块组织留在尼龙网上。iv.500rpm 离心 5 分钟，弃去上清液，加洗涤液至约 2ml 吹打均匀500rpm5min 重复离心一次，彻底去除酶液。v.加 8 滴洗涤液，悬浮原生质体。vi.镜检，检察原生质形态和浓度，看看是否有碎片，本试验中碎片较少，故未做蔗糖漂移。b)PEG 融合：i.在小平皿内各滴三滴原生质体悬液，静置沉淀。ii.各缓缓滴加一滴 PEG 在其中两滴原生质体悬液上，iii.在另一滴上滴加一滴高 Ca2+高 pH 洗液。iv.镜下观察，1-2 分钟后，在原先加入 PEG 的一滴悬液上加入一滴高Ca2+高 pH 洗液。v.镜检，记录结果。六、实验结果：（详见附图）加样种类现象PEG视野中的原生质没有明显的大范围的聚集运动，但原本挨得很近的原生质迅速的融合。高 Ca2+高 pH视野中的原生质有大范围的聚集运动，过一段时间后逐渐有原生质融合现象。PEG+ 高 Ca2+ 高pH视野中的原生质有大范围的聚集运动，并可以迅速融合，和只加高 Ca2+高 pH 的对比组区别不是很明显。七、实验讨论：a)关于几种融合技术的讨论：物理融合技术：现在常用的物理融合技术有电融和和激光融合技术。i.电融和：Zimmermann 在1978 年首先采纳电脉冲方法成功地诱导了细胞融合,开创了细胞融合技术的新局面。 它实现了装置化,比病毒法,化学法操作起来方便些,物理参数易精确测量,重复性较好的优点。 电融合法...