现代药理学实验方法与技术简介VIP专享

第一章现代药理学实验方法与技术简介 第一节分子生物学试验方法与技术 分子生物技术在药理学实验中应用较为广泛，包括核酸分子探针的标记、核酸分子杂交、多聚酶链反应、蛋白印迹杂交技术、cDNA 文库、随机分子库技术、外核基因在真核细胞中的表达、转基因动物、人类基因治疗等 。现将更为常用的技术介绍如下：一、核酸分子探针的标记 标记核酸分子探针（nucleic acid probe）是进行核杂交的基础，根据核酸分子探针的来源及性质进行选择，选择的基本原则是具有高度的特异性，探针选择直接影响杂交结果的分析。根据检测对象和目的不同，，可选择不同的探针种类及标记方法。㈠ 探针种类1．基因组 DNA 探针 是克隆化的各种基因片断，也是最常用的核酸探针，探针应尽可能选用基因编码（外显子），避开使用内含子及其它非编码序列。2．cDNA 探针 与 mRNA 互补的 DNA 链称 cDNA，是一种较为理想的核酸探针，特异性较高。3．RNA 探针 RNA 与 RNA 或 DNA 杂交体的探针稳定性，特异性高。4．寡核苷酸探针 人工合成寡核苷酸片段做探针，可根据需要合成相应序列。 ㈡ 标记物 常用的探针标记物有两类：放射性同位素和非放射性同位素。标记物的检测具有高度灵敏性和特异性。标记和探针结合不影响杂交的特异性和稳定性。其中放射性同位素是应用最多的探针标记物，但易造成放射性污染，多数同位素的半衰期短，不能长期存放。常用的放射性同位素有32P¸3P¸35S，有时也用 14C,125I 或 131I。二、核酸分子杂交（nucleic acid hybridiazation ） 是指具有一定同源序列的两条核酸单链在一定的条件下，按碱基互补配对原则形成异质双链的过程。核酸分子杂交是分子生物学领域应用最广泛的技术，灵敏度高、特异性强，主要用于特异 DNA 或 RNA 的定性定量检测。三、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外酶促扩增特异 DNA 片段的方法。传统的 DNA 扩增法是分子克隆法，需经过DNA 酶切、链接、转化等步骤构建含有目的基因的载体。然后导入细胞中进行扩增，再用同位素标记的探针进行筛选，操作复杂，耗时。PCR 技术灵敏度高，特异性强，操作简便。PCR 是本世纪分子生物学讨论领域中最重要的发明之一。四、cDNA 文库 是指以 mRNA 为模板，在反转录酶的作用下形成的互补 DNA（complementary DNA,cDNA）。cDNA 文库是指一群含重组DNA 细菌或嗜菌体克隆。每一个克隆只含一种 mRNA 的信息，足够数...