细胞凋亡诱导及检测伍国羽

Hela 细胞凋亡诱导及检测生 72 伍国羽 2025012357实验日期：2025 年 11 月 15 日 星期日1. 实验目的1) 了解和掌握诱导细胞凋亡的基本原理和实验方法。2) 巩固和提高细胞传代、细胞培育、显微镜操作等关键实验技术。3) 学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法2. 实验原理细胞凋亡(apoptosis)或程序化细胞死亡(programmed cell death,PCD)，是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一 ，并强调这一过程是一种自然的生理学过程。由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以又被称为程序化细胞死亡。DAPI 即 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)﹐为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链 DNA 结合而发挥标记的作用，可以产生比 DAPI 自身强 20 多倍的荧光，和EB 相比，对双链 DNA 的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记的效率高(几乎为 100 %) ，且对活细胞无毒副作用。DAPI 染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI 也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链 DNA 染色。细胞经热激处理后用 DAPI 染色 3 分钟，在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化。 3. 实验用品实验材料：HeLa 细胞实验用具：荧光显微镜，显微摄影系统，超净操作台，恒温培育箱，离心机，恒温水浴锅， EP 管，废液缸，细胞培育平皿，移液器，酒精灯，火柴，镊子，记号笔，酒精棉球，已灭菌枪头，载玻片，盖玻片。实验试剂：PBS 缓冲液； DMEM 培育基（DMEM+10%血清+1%双抗，pH 约 7.2）； 消化液（0.25%胰蛋白酶-EDTA 混合液）； H2O2 溶液（8.8mmol/L）； 固定液（甲醇溶液）；DAPI 染液。4. 实验步骤一、细胞凋亡的诱导 (1)将对数增长期的细胞用 0.25%胰酶消化，调整细胞数为 4×105/L，胞悬浮于 100μL DMEM 培育基(2)加 H2O2处理，至终浓度为 0.8mmol/L(3)24 小时后收集细胞进行染色和形态学观察。二、DAPI 染色1. 收集细胞(200uL 胰酶 37℃消化后，再加入 1mL 培育基)至 1.5mL EP 管，1000g 离心 5min2. 吸出上清，于沉淀中加入 100uL 甲醇，室温固定 10min3. 1000g 离心 5min4. 弃上清，加 100uL PBS 洗涤沉淀细胞5. 1000g 离心 5...