酵母单杂交实验步骤总结1

1 pBait-AbAi 载体的构建（酵母报道子的构建）注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到 pAbAi 载体 AbAir报告基因的上游。大量讨论表明最有效的构建应包含目的 DNA 三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于 20 bp 的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。（1） 设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与 pAbAi 载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列作为对比，以排除可能的假阳性）。（2） 用 TE buffer 溶解寡核苷酸至终浓度 100 mol/L。（3） 将正向链和反向链根据 1:1 的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为 50 mol/L）。（4） 95 C 保温 30 s，去除二级结构。（5） 72 C 保温 2 min，37 C 保温 2 min，25 C 保温 2min。注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。（6） 冰上放置。退火后的产物可贮存在-20 C 冰箱备用。（7） 酶切 1 L pAbAi 载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。（8） 将退火后的寡核苷酸稀释 100 倍至终浓度为 0.5 mol/L。（9） 在连接反应管中加入如下成分：pAbAi 载体（50 ng/L） 1.0 Lannealed oligonucleotide （0.5 mol/L） 1.0 L10×T4 DNA ligase buffer 1.5 LBSA（10 mg/mL） 0.5 LNuclease-free H2O 10.5 LT4 DNA ligase （400 U/L） 0.5 L总体积 15 L 注：假如有必要，可用 1 L nuclease-free H2O 代替寡核苷酸作为阴性对比。（10） 将反应体系室温放置连接 3 h，转化 E coli，采纳常规方法检测阳性克隆。注：可用酶切或测序进行检测。2 质粒转化酵母细胞，生成 Bait-Reporter 酵母菌株（图）图 3 Bait-Reporter 酵母菌株生成原理示意图（1） 用 BstB I 或者 Bbs I 酶切 2 L pBait-AbAi，pMutant-AbAi，p53-AbAi 质粒，使其在 URA3 基因处断开，纯化酶切产物。（2） 按 Matchmaker Yeast Transformation System 2 的步骤用 1 l 酶切后的质粒转化 Y1HGold 酵母。（3） 稀释每个转化体系至 1/10、1/100、1/1000，分别取每个稀释物均匀涂于SD/-Ura 琼脂平板上。3 d 后挑取 5 个单克隆，用 Matchmaker Insert Check PCR Mix1...