CCK8实验原理与步骤

CCK8 实验1、在 96 孔板中配置 100μl 的细胞悬液。将培育板在培育箱预培育24 小时(37℃，5% CO2）。2、向培育板加入 10μl 不同浓度的待测物质。3、将培育板在培育箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24 或 48小时)。4、向每孔加入 10μl CCK8 溶液（注意不要在孔中生成气泡,它们会影响 OD 值的读数）.5、将培育板在培育箱内孵育 1—4 小时。6、用酶标仪测定在 450nm 处的吸光度。7、若临时不测定 OD 值，可以向每孔中加入 10μl 0。1M 的 HCL 溶液或者 1％ w/v SDS 溶液，并遮盖培育板避光保存在室温条件下.24小时内测定，吸光度不会发生变化。PS：1％ w/v SDS 溶液配制方法：组份浓度：10％ （W/V）SDS配制量：100ml配制方法:1.称量 10g 高纯度的 SDS 置于 100—200ml 烧杯中，加入约 80ml 的去离子水,68℃加入溶解2.滴加浓盐酸调节 pH 值至 7。23。将溶液定容至 100ml 后，室温保存.注意：假如待测物质有氧化性或还原性的话，可在加 CCK8 之前更换新奇培育基(除去培育基，并用培育基洗涤细胞两次，然后加入新的培育基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培育基，直接扣除培育基中加入药物后的空白吸收即可.活力计算:细胞活力＊(％）=［A(加药）-A（空白）］/［A（0 加药）—A(空白）] ×100A（加药):具有细胞、CCK8 溶液和药物溶液的孔的吸光度A（空白）：具有培育基和 CCK8 溶液而没有细胞的孔的吸光度A（0 加药）：具有细胞、CCK8 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度＊细胞活力:细胞增殖活力或细胞毒性活力CCK—8 可以用于细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有 WST-8，它在电子载体(1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒染料,生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比,因此可以用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。其使用方法在增殖和毒性试验中有所区别:细胞增殖试验:1。接种细胞悬液 100 微升于 96 孔板,预先置于 37 度,5％CO2 饱和湿度的培育箱内培育2。在每孔内加入 10 微升的 CCK—8 试剂.3。把培育板放培育箱内 1—4 小时(根据细胞类型其时间有所不同）4 在 450nm 波长处测定吸光值,参比波长为 600nm 或以上波长.毒性分析试验:1.接种 100 微升细胞悬液（5000 个/孔）于 96 孔板2.预先放置 37 度 5%CO2 饱和湿度培育箱培育 24 小时3。加入 10 微升不同浓度的毒...