CCK8法检测细胞增殖预实验

SRT—1720, EX527 一定要应用在白血病细胞株起作用的浓度方可比较对 293T 细胞和白血病细胞株的不同影响,请重复实验。实验日期：2015/08/22—2015/08/27实验项目:CCK8 法检测细胞增殖实验地点：广西医科大学药基楼 14 楼生物靶向中心实验人员:高宗燕、宁海萍、李登峰实验目的：检测 SRT—1720/EX527 刺激 293T 细胞后对细胞增殖的影响主要试剂：SRT—1720， EX527,CCK8 试剂盒主要仪器：酶标仪实验步骤：一、制作标准曲线（测定细胞具体数量时)1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞至 96 孔板。2、设置 4 个细胞浓度梯度:0，2000，4000，8000,每组 4 个复孔。3、接种后培育 24 小时使细胞贴壁,然后加 CCK 试剂培育 4 小时后测定 OD 值,制作出一条以细胞数量为横坐标（X 轴）,OD 值为纵坐标（Y 轴）的标准曲线.根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入 CCK 后的培育时间。）y = 1262.4x2 - 822.82x + 255.31R2 = 0.9784010002000300040005000600070008000900000.511.522.53图一、标准曲线二、细胞增殖检测1、在 96 孔板中配置 100μL 的细胞悬液。将培育板在培育箱预培育 24 小时（在 37℃，5％ CO2的条件下）。2、向培育板加入 10μL SRT—1720（终浓度 3um）, EX527(终浓度 100um）。3、将培育板在培育箱孵育约 24h4、每孔加入 10μL CCK 溶液（注意不要再孔中生成气泡,它们会影响 OD 值的读数)。5、将培育板在培育箱内孵育 2 小时.6、用酶标仪测定在 450nm 处的吸光度。图二、3um SRT1720 刺激 293T 细胞后的细胞增殖曲线。该曲线呈 S 形，符合细胞正常生长情况。图三、100um EX527 刺激 293T 细胞后的细胞增殖曲线。该曲线前部分呈 S 形，符合细胞正常生长情况,但在进入对数期之后曲线有下滑，之后进入平台期。分析：SRT1720 为 SIRT1 特异性活化剂,在前期实验中对白血病细胞株的生长表现出抑制作用，此次实验中SRT1720 对正常细胞(293T)的生长无明显抑制作用。暗示 SIRT1 的活化对正常细胞的生长可能无明显影响.小剂量 EX527 为 SIRT1 特异性抑制剂，在前期实验中大剂量 EX527 对白血病细胞株的生长表现出抑制作用,而小剂量 EX527 无此效应，此次实验中大剂量 EX527 对正常细胞(293T）的生长可能有轻度抑制作用。但不能以一次实验结果做出肯定的结论，该实验还需重复。