PCR 疑难解答当 PCR 结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行： 将 PCR 反应的试管与反应板紧贴
当酶反应混合物以 70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后略微振荡一下，因为在0
2—ml 的 PCR 管中不能均匀传热
不要随意减少 dNTP 的用量,它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡
对于有问题的 PCR 反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加 Taq 酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常 PCR 扩增
没有扩增产物： 在提供 MgCl2 缓冲液中，以 0
25mmol/L 为梯度增加 MgCl2 浓度；无 MgCl2 的缓冲液以0
5 mmol/L 为梯度增加 MgCl2 浓度
泳道中出现模糊条带,假如 DNA 模板中存在 RNA，则按上述提示浓度补加 MgCl2，因为在PCR 反应中可能缺少游离的 Mg2+
检查退火温度和变性条件，假如有需要的话，可降低退火温度
检查模板和引物的用量
增加循环次数和/或模板 DNA 的用量
泳道中出现模糊条带： 减少循环次数或模板 DNA 的用量
提高退火温度，但不要超过 68℃
重新设计引物或设计更长的引物
其他值得注意的条件: 建议使用 0
2—ml 薄壁管
厚壁管在 92℃时不能有效地使模板变性
最佳反应体积为 50ml，推举用 30ml 矿物油覆盖(对盖子加热的 PCR 仪可以不加）
大多数反应中，0
75ml(0
5～1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果
建 议 使 用 1
75mmol/L MgCl2∶350mmol/L dNTP 或 2
25mmol/L MgCl2∶500mmol/L dNTP 组合的混合物
然而要得到最佳结果，优化 Mg2+的浓度是必需的
基因组 DNA 模板的质量显著影响 PCR 反应
因此推举使用琼脂糖凝胶电泳来检测
