蛋清溶菌酶的制备及活力测定一、实验目的1.熟悉溶菌酶的功能、分布以及作用特性。2.掌握溶菌酶的提取及活力测定方法。二、实验原理溶菌酶又称胞壁质酶或 N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种碱性糖苷水解酶，能作用于细菌细胞壁的粘多糖，具有杀菌等作用，广泛应用于医学临床。溶菌酶存在于植物浆及动物(蛋清、血浆、淋巴液和鼻粘膜等处)组织中，其中鸡蛋清中含量较为丰富，且鸡蛋清取材方便，因此实验室及实际生产中一般以鸡蛋清为原料进行溶菌酶的提取制备。从鸡蛋清中分离溶菌酶可以选用多种不同的方法和步骤。本实验采用的分离纯化步骤为：等电点及热变性选择性沉淀→聚丙烯酸处理→葡聚糖凝胶柱层析→聚乙二醇浓缩。溶菌酶具有耐热性，在酸性条件下经受长时间高温处理而不丧失活性；而且溶菌酶又具有特别高的等电点，因此采用热变性与等电点沉淀相结合的方法可除去大部分的杂蛋白。聚丙烯酸是一种多聚蛋白质，在酸性条件下可以与溶菌酶结合形成凝聚物；当有钙离子存在时溶菌酶又能从这种凝聚物中分离出来，同时生成丙烯酸钙沉淀，后者经过硫酸的酸化又重新形成聚丙烯酸。在实验中，一旦提取液中溶菌酶与聚丙烯酸结合，所形成的凝聚物会立即粘附于试管的底部，倾去上层液体可使溶菌酶既得到纯化，又得到浓缩。最后再用葡聚糖凝胶柱层析，使杂蛋白、溶菌酶和钙离子分开。三、仪器和试剂仪器玻璃层析柱(2.5cm×34cm)、电热恒温水浴锅、离心沉淀机、10μL 微量进样器、721 型分光光度计。试剂1. Sephadex G-502. 1%NaCl—0.05mol/LHCl3. 20%HAc4. 10%聚丙烯酸(现配现用)5. 0.5mol/LNa2CO36. 500g/LCaCl27. NaCl8. 6g/LNaCl9. 饱和草酸溶液；10. 细菌悬液：取 1g 艳红 K-2BP 标记的微球菌 M.lysodeikticus 悬于 100mL0.5mol/L 的pH6.5 磷酸缓冲液中，置于冰箱内保存备用。11. 乳化剂：2g Brij-35(聚氧乙烯脂肪醇醚)加 50mL 蒸馏水微热使溶解，冷却后定容至100mL。吸取此液 10mL 用 0.6mol/LHCl 定容至 200mL 备用。12. 0.5mol/L 的 pH6.5 磷酸缓冲液。四、操作步骤(一)蛋清溶菌酶的分离提取1.变性与等电点选择性沉淀：取新鲜蛋清用 1%NaCl-0.05mol/LHCl 溶液搅拌稀释，加 20%HAc 调至 pH4.6，3000r/min 离心 10min，收集滤液并记录体积，留样 2mL(Ⅰ)待分析。将滤液置于沸水浴使 3min 内迅速升温至 75℃，用流动水速冷后，3000r/min 离心 20min，收集上清液，纪录体积，并留样 2mL(Ⅱ)待分析。2.丙...
