《生物技术大实验》讲义实验一枯草芽孢杆菌对棉花黄萎病的拮抗作用实验目的：进一步掌握无菌操作技术，加深对微生物之间互作的进一步认识实验原理：枯草芽孢杆菌分泌到体外的带谢产物能够抑制棉花黄萎病的生长供试菌株(1)拮抗菌株:枯草芽孢杆菌（冰箱保存）(2)病原菌株:棉花黄萎病菌（冰箱保存）实验步骤1.培养基的制作(1)PD培养液：(2)PDA培养基：查氏培养液：按上述配方配制查氏液体50ml及固体胶培养基125ml分别装在250的三角瓶中，121℃条件下灭菌30分钟。2.接种培养(1)在无菌操作条件下，将棉花黄萎病菌接种在查氏培养液中，28℃振荡培养4天。(2)将枯草芽孢杆菌在PD培养液中28℃培养24小时3.抑菌试验(1)平板制备：将固体PDA培养基溶化后倒入培养皿中，制成平板(2)棉花黄萎病菌液涂皿：将棉花黄萎病菌液用玻棒均匀的涂布在查氏平板培养基上(3)枯草芽孢菌的接种：将圆滤纸片放置在平板培养基上，用吸管吸取少许枯草芽孢杆菌菌悬液滴到滤纸片上(4)培养：28℃培养箱中培养4天(5)观察结果实验二酶联免疫法测ABA含量仪器：酶联免疫仪酶标板752分光光度计实验原理本方法是一种固相抗原型酶联免疫法(EnzymeLinkedImmunoSorbentAssayELISA),先将ABA蛋白质复合物与固相载体(聚苯乙烯微量滴定板)结合,然后将待测的ABA(样品或标准品)和兔抗ABA抗体加入微量滴定板的孔中,进行竞争反应,接着弃去上清液,洗涤固相表面,加入酶标二抗使其与结合在固相ABA上的抗体反应,最后去除多余的未反应的酶标二抗,测定与固相结合的酶活性,酶活性和待测ABA含量呈负函数关系,即固相ABA结合的抗体与酶标二抗量(OD或B%)随待测ABA含量增加而减少,以一系列已知浓度的ABA的OD值制图而获得标准竞争性抑制曲线,对于未知样品B,只要在同样条件下测定反应后的OD值,就可以从标准曲线上查到ABA的量。测定方法1、包被：在微量滴定板内准确加入100μLABA包被液，37℃湿盒过夜。2、标样稀释?：取8支试管每管加150μLDB，第一管中加入50μL（2000ng／50μL）标准液，充分涡旋后，取50μL至第二号管中，同样涡旋后，取50μL到第三管；依次稀释到第六管，稀释后的标准ABA依次为1000ng、500ng、250ng、125ng、62.5ng、31.25ng、15.625ng、7.8125ng／50μL。3、洗板：从37℃湿盒中取出滴定板，恢复到室温后，弃去包被液，用WB（洗涤缓冲液）洗涤三次，甩干（吸水纸）。4、加样：1～8孔对应加入ABA标样50μL，10号孔相应加入最浓ABA标样，9号孔加50μLDB，三排重复；然后每孔加50μL抗体，37℃45分钟。5、洗板：6、加酶标二抗：每孔加100μL，37℃反应1小时。7、洗板：8、显色：各孔加10μLOPD显色液，37℃20分钟。9、终止反应：各孔加50μL6NH2SO4。10、读数：490nm读取OD值。其中10号孔调零,而9号孔为最大值(B0),1~8号孔的OD值为B。11、结果计算：以In（B/B0）∕（1－B/B0）为纵坐标，以标准ABA浓度的常用对数（lg［ABA］）为横坐标,绘制曲线。实验三质粒DNA的提取及其酶切实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA。实验原理碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那木迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。实验步骤（一）提取质粒1.将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入试管中，接入上述的含pUC19质粒的大肠杆菌单菌落，37℃振荡培养过夜。2.取培养物倒入微量1.5ml离心管中，4000r/min离心2min。3.弃上清，吸尽残液，使细胞沉淀尽可能干燥。4.加入100ul溶液Ⅰ，充分混匀，室温放置10min。5.加200ul溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管盖，轻轻颠倒数次混匀，将离心管放冰上5min。6.加入150ul溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次...
