聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用VIP免费

第1页共11页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第1页共11页聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的K.Mullis发明，并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。一、PCR反应原理和反应过程DNA的体外复制包括3个步骤：变性（denaturation）:94C~95C退火（annealing）:40C~70C延伸（extension）:72C3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。二、PCR的反应体系和反应条件（一）PCR反应体系参与PCR反应的主要成份:模板、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶和缓冲液等。1模板包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等。RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为扩增的模板。模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng2、引物（Primers）引物决定PCR扩增产物的特异性和长度，是化学合成的寡核苷酸片段。引物的合成可以采用化学方法。引物设计时必须遵循一些原则。设计引物的原则：1）二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补2）长度为18~25个核苷酸第2页共11页第1页共11页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第2页共11页3）二条引物之间避免形成引物二聚体4）引物的碱基组成应平衡5）引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+（C+G）6）引物的5`端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）3、脱氧核苷三磷酸（dNTP）是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧核苷三磷酸的混合物。反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致，浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加dNTP浓度：20~200umol/L,浓度升高增加非特异性扩增。4、DNA聚合酶从一种生活在热泉（80℃~90℃）中的水栖噬热菌（Thermusaquaticus,Taq）中提取，有很高的耐热稳定性。Taq酶的作用:模板指导下，以dNTP为原料，在引物3’-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3’,5’-磷酸二酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸，催化DNA合成。最适酶量：1-2.5U（酶量过多，导致非特异性扩增）TaqDNA聚合酶复制的保真性，TaqDNA聚合酶无3’→5’外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。TaqDNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000，故扩增的片段越长，错配的机率越高。耐热的DNA多聚酶有PwoDNApolymerase、TthDNApolymerase、PfuDNApolymerase具有较高的热稳定性，较高的保真性，降低碱基错配率2~10倍。5、镁离子浓度镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq酶的活性有直接影响。虽然Taq酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关，但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及鳌合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离Mg2+的浓度从而影响酶的活性。当dNTP浓度为200umol/L时，MgCl2的浓度为1.5mmol/L较宜。6、其它反应因素pH：调节至酶反应所需的最适pH（pH=7.2左右）第3页共11页第2页共11页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第3页共11页盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交基质：BSA、gelatin、Tween20、DTT等（牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq酶的活性）（二）PCR的反应条件反应温度（变性、退火、延伸）反应时间（变性、退火、延伸）循环次数（PCR效率及产物量）1、温度变性温度：94~97℃退火温度：低于引物Tm5℃左右。温度过高会降低扩增效率；温度过低：增加非特异性扩增。延伸温度：72度，此时Taq酶具有较高的酶促活性。2、时间第一次变性应给予足够时间（5~7分钟）。每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为30秒~1分钟，时间过长易导致非特异性扩增3、循环次数重复次数一般设为25～35个循环扩增反应的平台效应：理论上，PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增25-25个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早。平台效应产生的因素：引物二聚体...