第1页共15页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第1页共15页葡萄酒中苹果酸的测定原理:利用MegaQuantTM(专利技术)测定L-苹果酸需要进行三步酶解反应，第一步：在L-苹果酸脱氢酶(L-MDH)的催化作用下，L-苹果酸被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)氧化生成草酰乙酸：(1)L-苹果酸+NAD+(L-MDH)oxaloacetate+NADH+H+第二步：加入过剩的L-谷氨酸，在谷草转氨酶的作用下，生成L-天门冬氨酸和2–酮戊二酸(2)Oxaloacetate+L-glutamate(GOT)L-aspartate+2-oxoglutarate第三步：在心肌黄酶的催化作用下，NADH还原碘硝基氯化四氮唑(INT)，生成甲基-INT(3)NADH+INT+H+(diaphorase)NAD++甲基-INT生成的甲基-INT的量取决于L-苹果酸的量，甲基-INT的吸光度值可在505nm下测量。特异性,灵敏度,测量范围和精确度:该实验方法是专门用于测定L-苹果酸含量的。第2页共15页第1页共15页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第2页共15页最小可调吸光光度为0.01个吸光单位，样品体积为20uL，此时的L-苹果酸浓度为7.7mg/L。如果最小可调吸光光度为0.02吸光光度，样品体积为20uL，此时的L-苹果酸检测线为15.4mg/L。该实验的测量范围为0.15-15ugL-苹果酸(对于20uL样品液中的浓度为0.007-0.75g/L)，同一样品分别进行两次测定，其吸光度值会有0.01-0.02吸光单位的变化，对于样品体积为20uL，此时的L-苹果酸浓度大约在7.7-15.4mg/L之间，如果样品是经过稀释的，在计算结果时候需要乘以相应的稀释系数（F）,如果在样品制备阶段，样品的重量是被称量的，如：10g/L,0.02-0.05g/100g的细微差别能够被分辨。干扰:红酒中的酚醛树脂会对本试验造成干扰，引起INT的“缓慢反应”（图2），因此在对未稀释的红酒进行测定时，必须首先用聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）净化样品。“缓慢反应”同样也发生在未稀释的白葡萄酒中，按照提供的方法进行测定，其缓慢反应速率非常的慢。在用MegaQuantTM测定L-苹果酸的时候，对于存在的两种潜在的次要误差原因的认可是非常有必要的：1.使用PVPP去除了红酒中的大部分酚醛树脂，但是还是存在着“缓慢反应”，由于用PVPP处理过的葡萄酒（导致潜在的高估白葡萄酒中的L-苹果酸0.00-0.01g/L，或红葡萄酒中的浓度0.00-0.03g/L）其中存在的“缓慢反应”非常的慢，因此可以忽略不计（实验方法第3页共15页第2页共15页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第3页共15页A），然而，如果想得到精确的结果，可以通过实验方法B精确计算得到。2.推荐使用PVPP药片的测试方法（如每5mL葡萄酒用1个药片）中，导致了对样品浓度进行了2%(v/v)稀释，计算方法中考虑了这一点（请参照用PVPP处理样品方法）还原性物质能够干扰试验，引起“缓慢反应”，如：亚硫酸亚和抗坏血酸盐，但是仅仅能够对浓度不是很高的葡萄酒样品进行测定，如亚硫酸盐浓度在4g/L，如果样品中的抗坏血酸盐含量非常高(>400mg/L)，则不能进行测定。向已完成反应的试管中添加L-苹果酸（每20uL添加7.5ug），通过增加的吸光度值进一步验证其他干扰的影响，利用附带的内部的标准质控可以对干扰物质进行鉴定。通过向样品中添加标准质控做定量回收试验，计算样品在处理和提取时的损失。安全性:L-苹果酸测定所使用的试剂没有有毒物质。然而浓缩缓冲液中含有作为防腐剂用的叠氮化钠(0.02%w/v)，需要按照实验室安全操作规程进行试验。试剂盒:MegaQuantTML-苹果酸含量测定试剂盒可以进行60次的测定试验，并提供有全部的试验方法：58次测定试剂盒(cat.no.K-LMALR)瓶1:双甘氨肽缓冲液(100mL,100mM,pH10.0)+L-谷氨酸(100mM)+第4页共15页第3页共15页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第4页共15页叠氮化钠(0.02%w/v)稳定性>2年，4°C保存。瓶2:药片（60粒）-含有心肌黄酶,GOT,INT,FAD和NAD+，使用前要先恢复至室温在打开稳定性>2年，-20°C;干燥保存。瓶3:L-苹果酸脱氢酶(1.3mL,15,000U/mL)稳定性>2年，4°C保存。瓶4:L-苹果酸质控标准液(5mL,0.375mg/mL)稳定性>2年，4°C保存。瓶5:药片（65粒）-含有PVPP稳定性>5年，室温保存。试剂制备:1.备用试剂盒中的瓶1溶液...
