细菌转化与平板筛选doc-西南大学·农学与生物科技学院欢VIP免费

第1页共7页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第1页共7页重组DNA的转化和蓝白筛选体外连接的重组DNA分子导入合适的受体细胞才能进行大量复制，增殖和表达，其首要目的是获得大量的克隆基因。虽然PCR技术，体外转录及翻译系统能部分达到大量扩增的目的，但毕竟受到体外操作的许多限制。重组质粒导入宿主细胞最常用的方法之一就是转化（transformation）。转化这一概念来源于遗传学：细菌细胞的生物学由于吸收外源DNA发生可遗传的改变叫转化。很多细菌如杆菌，链霉菌属能自然发生转化，其它菌属包括大肠杆菌自然状态下无法发生转化，但可以通过人工诱导使其处在易于接受外源DNA分子的状态即感受态（competence），从而使转化得以高效率地进行。大肠杆菌的转化简便易行，它在分子克隆中占据极为重要的地位。重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细菌内，这项技术始于Mandel和Higa1970年的观察，他们发现细菌经过冰冷的CaCl2溶液处理短暂热休克后，容易被噬菌体感染，随后Cohn于1972年进一步证明质粒DNA用同样的方法也能进入细菌。其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘付于细胞表面，经42℃短时间的热激处理，促进细胞吸收复合物。在富裕培养基中生长一小时后，质粒拷贝数增加，抗性基因得以表达，球形的感受态细胞得以复原。最后通过含抗生素的抗性平板筛选转化菌落。其过程图5所示。质粒转化大肠杆菌的过程Ca2+处理的感受态细胞，一般转化率为105-106/ugDNA。环化重组质粒愈小，转化率愈高，环状DNA分子比线状DNA分子的转化率高。在Ca2+的基础上，联合其他金属离子（如Mn2+、Co2+），DMSO或还原剂等物质处理细菌，使转化率提高数百倍。除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂第2页共7页第1页共7页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第2页共7页的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高达到109-10/ugDNA，因操作简便愈来愈为人们所接受。基因克隆的最后一道工序就是从众多的转化菌中筛选出目的阳性克隆并鉴定重组子的正确性。通过细菌培养以及重组子的扩增，从而获得目的基因的大量拷贝，进一步研究该基因的结构、功能或表达产物。从大量的菌落或噬菌斑中鉴定出重组子有许多方法，如插入失活法、抗性筛选、蓝白筛选、杂交筛选、免疫学筛选、酶切图谱鉴定、PCR鉴定等。而蓝白筛选常用在重组子和非重组子的初步筛选中，它是通过载体和宿主菌之间基因内互补来实现。许多载体（如pUC,pBS等）都是带有包括乳糖操纵子的调控序列和编码β-半乳糖苷酶前146个氨基酸的基因序列。并在编码区中构建了多克隆位点，它不破坏读框，可使几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶基因的氨基端，而不影响功能。若有外源基因插入多克隆位点则破坏编码读框产生没活性的α肽段。宿主菌为缺失产生α肽段的突变体，但能产生其余肽段。两者之间进行基因内互补就产生有活性的β-半乳糖苷酶基因。β-半乳糖苷酶基因在IPTG的诱导下产生肽段与宿主菌其余肽段结合成有活性的β-半乳糖苷酶。此酶能使显色底物X-gal分解成蓝色化合物，从而使菌落发蓝。若有外源片段插入载体的多克隆位点，则使β-半乳糖苷酶基因失活，不能产生α肽，形成白色菌落。利用此方法仅通过目测就轻而一举地筛选出重组菌落。一、材料，试剂和仪器1材料:受体菌DH5α，含lacZ`的重组质粒。2试剂:1）LB固体培养基2）LB液体培养基4）0.1mol/LCaCl25）抗生素母液6)0.5mol/LIPTG7)100mg/mLX-gal第3页共7页第2页共7页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第3页共7页第4页共7页第3页共7页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第4页共7页常用抗菌素的作用方式及其抗性机理第5页共7页第4页共7页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第5页共7页3仪器:恒温摇床，冰冻离心机，恒温培养箱，CaCl2转化法(1)划线复壮宿主菌37℃过夜。挑一单菌落...