第1页共13页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第1页共13页实验20质粒DNA的提取与鉴定授课题目：质粒DNA的提取与鉴定（6学时）授课对象：生科专业授课教师：教学目标及基本要求：1、学习和掌握快速提取质粒DNA的原理和方法。2、学习和掌握质粒DNA的鉴定。3、采用开放性实验教学。教学内容提要及时间分配：1、实验原理讲解：8分钟碱变性法提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离的目的。在pH值高达12.6的碱性环境中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条链不会完全分离。当用pH值4.8的KAc或NaAc高盐缓冲液调节其pH值到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中；而线状染色体DNA则不能复性，形成缠绕的网状物,通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物一起沉淀下来而被除去，用乙醇或异丙醇将溶于上清液中的质粒DNA沉淀，再用RNase除去RNA，即可获得较纯净的质粒DNA。2、实验试剂与器材6分钟溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱。溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/LNaOH母液稀释），1％SDS（从10%SDS母液中稀释，SDS母液可室温保存），现配现用。溶液Ⅲ：5mol/LKAc60mL，冰醋酸11.5mL，H2O28.5mL，高压灭菌，4℃冰箱保存。溶液终浓度为:K+3mol/L,Acˉ5mol/L。3mol/L醋酸钠(pH5.2)：800mL水中溶解408.1gNaAc·3H2O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100mL，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。STE缓冲液：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。TE缓冲液：10mmo/LTris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。高压灭菌后储存于第2页共13页第1页共13页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第2页共13页4℃冰箱中。3、实验步骤讲解：6分钟将含有质粒pGFPuv的DH5α菌种划线接种在LB固体培养基（含有100μg/mLAmp）上，37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5mLLB液体培养基(含有100μg/mLAmp)中，37℃振荡培养14~16小时。取1.5mL培养液加入1.5mL离心管中，室温12,000r/min离心1分钟。加入500μLSTE，涡旋打匀，室温12,000r/min离心1分钟。弃上清，将管倒置于纸巾，使液体流尽。加入100μL溶液Ⅰ重悬菌体，涡旋振荡，冰浴5分钟。加入新配制的溶液Ⅱ200μL，盖紧管口，快速轻柔颠倒5次，至溶液澄清(千万不要振荡)，冰浴5分钟。加入150μL预冷的溶液Ⅲ，盖紧，管口朝下，轻柔振荡5~10次，冰浴5~10分钟，12,000r/min离心10分钟。取上清移入干净Eppendorf管中，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，剧烈振荡20秒。室温下12,000r/min离心5分钟，可见溶液分三层，上层为质粒DNA溶液，中层为蛋白层，下层为有机相。取上清，加入400μL氯仿:异戊醇(24:1)，剧烈振荡20秒。12,000r/min离心5分钟。加入1/10体积3MNaAc，2倍体积无水乙醇，4℃沉淀10分钟或室温沉淀20分钟。12,000rpm离心10分钟。去上清，加入1mL75%乙醇，洗涤沉淀以去盐。12,000rpm离心10分钟。去上清，吸出痕量剩余乙醇，风干。将沉淀溶于30μLTE缓冲液(pH8.0，含20μg/mLRNaseA)中，储于-20℃冰箱中。如直接酶切，可将沉淀溶于30~50μLddH2O（含20μg/mLRNaseA）。利用比色法测定质粒DNA在260nm和280nm下的光吸收值并计算样品浓度。用1%琼脂糖凝胶电泳观察质粒DNA的纯度和条带。教学重点及难点：1、碱变性法提取质粒DNA的原理。第3页共13页第2页共13页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第3页共13页教学方法：采用启发式教学，结合理论，对实验步骤进行分析并给于适当示范。教学手段（挂图、幻灯、多媒体…等）：板书，PPT。使用的教材及参考资料：1、《现代生物学实验》，熊大胜主编，中南大学出版社，20052、《分子生物学实验指导》，魏群主编，高等教育出版社，20063、《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克等著金冬雁、黎孟枫等译科学出版社1999思考题：1、碱法提取质...
