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OchratoxinA(OTA)制备赭曲霉素A化学分子式为C20H18ClNO6,分子量为403.8,是无色结晶化合物,学名为:7-羟基-5-氯-3,4,二氢-8-羟基-3-甲基异香豆素-7β-苯丙氨酸(L-phenylalanine-N-[5-chloro-3,4-dihydro-8-hydroxy-3-methyl-1-oxo-1H2-benzopyran-7-yl]–carbonyl-(R)-isocoumarin)。OTA是一种酸性分子,羧酸基团的pKa是4.4,苯环的pKa是7.1;OTA也是一种荧光物质,长波紫外光下显示绿色或黄绿色荧光,碱性条件下紫外检测为蓝色荧光。它在苯溶液中的紫外的特征吸收波长为333nm,易溶于极性有机溶剂,例如:甲醇、乙醇、苯、乙腈、乙酸乙酯、三氯甲烷,也可以溶解在碱性水溶液中,不溶于己烷、石油醚、乙醚和酸性水溶液,酸水解后形成苯丙氨酸和OTα。实验仪器生物安全柜,摇床(恒温、避光),通风厨,pH计,旋转蒸发仪,紫外成像仪,高效液相色谱;培养皿,250ml三角瓶,玻璃板,纱布,滤膜(有机0.45uM),大钥匙,1ml,5ml移液枪实验材料及药品赭曲霉菌种,PDA培养基,玉米渣;氯仿,碳酸氢钠,磷酸,浓盐酸,甲醇,硅胶粉(200-300目),CMC(羧甲基纤维素钠),甲苯,乙酸乙酯,甲酸,乙腈(色谱醇),乙酸实验步骤一、OTA的培养:1.菌株3.4412保存:灭菌(平皿、PDA培养基38g溶于1L水),冷却后倒平板,凝固后划线接菌株3.4412,封口膜封口,28℃培养箱倒置培养。2.菌株3.4412分别接种到产毒扩大培养基:称60g玉米渣于250ml三角瓶中,灭菌(同时灭菌的有水,大钥匙,1ml枪头,5ml枪头),在生物安全柜接菌,用灭菌水溶出培养基上的菌稀释成菌液,每60g玉米加约3ml菌液,补齐水(18%),搅拌均匀。在28℃、200rpm的条件下避光培养,16-21天(21d最佳)进行毒素提取。二、OTA提取1.生物安全柜紫外灯消毒二十分钟。分别向各个三角瓶中加入20ml0.1mol/LH3PO4和200ml氯仿的混合溶液,搅拌均匀,静置一下午。注:操作过程戴口罩,防止吸入赭曲霉孢子;使用完毕,紫外消毒十分钟后再将使用过的三角瓶等取出。2.用纱布漏斗过滤下午静置的溶液,收集滤液;再向玉米滤渣加入20ml0.1mol/LH3PO4和200ml氯仿的混合溶液,搅拌均匀,过夜;过滤,收集滤液。3.按照滤液:3%NaHCO3=1:1,两者混合均匀后倒入分液漏斗中,静置分层,收集上层NaHCO3层;下层氯仿NaHCO3再洗一遍,静置回收氯仿层至瓶里,收集上层NaHCO3。4.浓盐酸调NaHCO3层溶液至pH值为2~3。5.按照滤液:CHCl3=1:1,两者混合均匀后倒入分液漏斗中,静置分层,收集下层氯仿;上层再用CHCl3洗一遍,收集氯仿层。6.水洗回收的氯仿,洗两遍。7.旋转蒸发:开电热(温度调至60℃),真空泵,冷凝水,圆底烧瓶中加1/3氯仿,开电机降至两者液面平。(真空压强在6~7,当压强增大时说明已蒸干)关机时先放气再关真空泵开阀门降低压强,再取下烧瓶加溶液。同时回收馏分氯仿。蒸干圆底烧瓶呈黄色。8.薄层层析:玻璃板洗净晾干,硅胶粉1g:1ml0.8%CMC在研钵中沿同一方向搅拌混匀,至无气泡,倒在玻璃板上铺匀,晾干(夏天2-3天,冬天需5-7天)。CMC难溶,需提前20天配制。95℃活化硅胶板1.5小时。甲醇洗瓶,点样(距胶板纵向一端边缘2~3cm,注意点成一排直线,可用1ml注射器,枪加样时不要碰到硅胶板表面,样品干燥后可再加一层,总量不超过2ml)。展开剂:甲苯:乙酸乙酯:甲酸=6:3:1配500ml展开剂(甲苯300ml:乙酸乙酯150ml:甲酸50ml),在通风橱里倒约300ml展开剂在桶里,保鲜膜封口,静置饱和15min。点好样干燥的硅胶板纵向放入展开剂中,不要淹没样品,待样品至边缘0.5~1cm处(约30分钟)取出,在通风橱里吹干。9.紫外拍照,划出亮带。刮下亮带处的硅胶,用甲醇洗至甲醇无色,滤纸漏斗过滤(此步较慢)。10.旋转蒸干:甲醇温度大约设在72~74℃,压强在7~8。11.用约5ml甲醇溶圆底烧瓶中毒素,0.45um有机滤膜针筒过滤(去除杂质以防止堵柱子),放在小瓶里,-20℃,锡纸避光。12.液相流动相,乙腈:水:乙酸=100:100:1配乙腈400ml:水400ml:乙酸4ml,溶液用色谱纯,配好后超生30min去除气泡。稀释100倍:990ml甲醇+10ml毒素稀释10000倍:990ml甲醇+10ml100*毒素稀释100000倍:900ml甲醇+10ml10000*毒素液相的标准曲线换一台机...

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