蛋白提取纯化试验方案VIP免费

OchratoxinA（OTA）制备赭曲霉素A化学分子式为C20H18ClNO6，分子量为403.8，是无色结晶化合物，学名为：7-羟基-5-氯-3,4,二氢-8-羟基-3-甲基异香豆素-7β-苯丙氨酸(L-phenylalanine-N-[5-chloro-3，4-dihydro-8-hydroxy-3-methyl-1-oxo-1H2-benzopyran-7-yl]–carbonyl-(R)-isocoumarin）。OTA是一种酸性分子，羧酸基团的pKa是4.4，苯环的pKa是7.1；OTA也是一种荧光物质，长波紫外光下显示绿色或黄绿色荧光，碱性条件下紫外检测为蓝色荧光。它在苯溶液中的紫外的特征吸收波长为333nm，易溶于极性有机溶剂，例如：甲醇、乙醇、苯、乙腈、乙酸乙酯、三氯甲烷，也可以溶解在碱性水溶液中，不溶于己烷、石油醚、乙醚和酸性水溶液，酸水解后形成苯丙氨酸和OTα。实验仪器生物安全柜，摇床（恒温、避光），通风厨，pH计，旋转蒸发仪，紫外成像仪，高效液相色谱；培养皿，250ml三角瓶，玻璃板，纱布，滤膜（有机0.45uM），大钥匙，1ml，5ml移液枪实验材料及药品赭曲霉菌种，PDA培养基，玉米渣；氯仿，碳酸氢钠，磷酸，浓盐酸，甲醇，硅胶粉（200-300目），CMC（羧甲基纤维素钠），甲苯，乙酸乙酯，甲酸，乙腈（色谱醇），乙酸实验步骤一、OTA的培养：1.菌株3.4412保存：灭菌（平皿、PDA培养基38g溶于1L水），冷却后倒平板，凝固后划线接菌株3.4412，封口膜封口，28℃培养箱倒置培养。2.菌株3.4412分别接种到产毒扩大培养基：称60g玉米渣于250ml三角瓶中，灭菌（同时灭菌的有水，大钥匙，1ml枪头，5ml枪头），在生物安全柜接菌，用灭菌水溶出培养基上的菌稀释成菌液，每60g玉米加约3ml菌液，补齐水（18%），搅拌均匀。在28℃、200rpm的条件下避光培养，16-21天（21d最佳）进行毒素提取。二、OTA提取1.生物安全柜紫外灯消毒二十分钟。分别向各个三角瓶中加入20ml0.1mol/LH3PO4和200ml氯仿的混合溶液，搅拌均匀，静置一下午。注：操作过程戴口罩，防止吸入赭曲霉孢子；使用完毕，紫外消毒十分钟后再将使用过的三角瓶等取出。2.用纱布漏斗过滤下午静置的溶液，收集滤液；再向玉米滤渣加入20ml0.1mol/LH3PO4和200ml氯仿的混合溶液，搅拌均匀，过夜；过滤，收集滤液。3.按照滤液：3%NaHCO3=1：1，两者混合均匀后倒入分液漏斗中，静置分层，收集上层NaHCO3层；下层氯仿NaHCO3再洗一遍，静置回收氯仿层至瓶里，收集上层NaHCO3。4.浓盐酸调NaHCO3层溶液至pH值为2~3。5.按照滤液：CHCl3=1：1，两者混合均匀后倒入分液漏斗中，静置分层，收集下层氯仿；上层再用CHCl3洗一遍，收集氯仿层。6.水洗回收的氯仿，洗两遍。7.旋转蒸发：开电热（温度调至60℃），真空泵，冷凝水，圆底烧瓶中加1/3氯仿，开电机降至两者液面平。（真空压强在6~7，当压强增大时说明已蒸干）关机时先放气再关真空泵开阀门降低压强，再取下烧瓶加溶液。同时回收馏分氯仿。蒸干圆底烧瓶呈黄色。8.薄层层析：玻璃板洗净晾干，硅胶粉1g：1ml0.8%CMC在研钵中沿同一方向搅拌混匀，至无气泡，倒在玻璃板上铺匀，晾干（夏天2-3天，冬天需5-7天）。CMC难溶，需提前20天配制。95℃活化硅胶板1.5小时。甲醇洗瓶，点样（距胶板纵向一端边缘2~3cm，注意点成一排直线，可用1ml注射器，枪加样时不要碰到硅胶板表面，样品干燥后可再加一层，总量不超过2ml）。展开剂：甲苯：乙酸乙酯：甲酸=6：3：1配500ml展开剂（甲苯300ml：乙酸乙酯150ml：甲酸50ml），在通风橱里倒约300ml展开剂在桶里，保鲜膜封口，静置饱和15min。点好样干燥的硅胶板纵向放入展开剂中，不要淹没样品，待样品至边缘0.5~1cm处（约30分钟）取出，在通风橱里吹干。9.紫外拍照，划出亮带。刮下亮带处的硅胶，用甲醇洗至甲醇无色，滤纸漏斗过滤（此步较慢）。10.旋转蒸干：甲醇温度大约设在72~74℃，压强在7~8。11.用约5ml甲醇溶圆底烧瓶中毒素，0.45ｕm有机滤膜针筒过滤（去除杂质以防止堵柱子），放在小瓶里，-20℃，锡纸避光。12.液相流动相,乙腈：水：乙酸=100：100：1配乙腈400ml：水400ml：乙酸4ml，溶液用色谱纯，配好后超生30min去除气泡。稀释100倍：990ml甲醇+10ml毒素稀释10000倍：990ml甲醇+10ml100*毒素稀释100000倍：900ml甲醇+10ml10000*毒素液相的标准曲线换一台机...