试验4细胞骨架的显示及观察VIP免费

细胞生物学实验实验42015/4/13实验4细胞骨架的显示及观察姓名：李思露学号：131140040一、实验目的1.掌握用考马斯亮蓝R250染色观察动物和植物细胞骨架的原理和方法。2.了解免疫荧光法检测细胞成分的原理和方法。二、实验原理1.细胞骨架：指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，包括微管（microtubule，MT）、微丝（microfilament，MF）、中间纤维（intermediatedfilament，IF）。2.微管微管是细胞内由微管蛋白形成的直径约20~26nm的长度不一的小管。分布在核周围，呈放射状向胞质四周扩散，主要确定膜性细胞器的位置和作为膜泡运输的导管。微管蛋白有α和β两种。αβ异二聚体沿纵向聚合成丝，原丝成环状排列形成微管的壁。微管不稳定，对低温（冷冻）、高压等物理因素及秋水仙素（微管断裂剂）等化学因素敏感。紫杉醇可以和微管蛋白多聚体结合，抑制微管解聚。3.微丝：真核细胞内是主要由肌动蛋白（actin）组成的直径为5～7nm的骨架纤丝。主要分布在细胞质膜的内侧，作用是确定细胞表面特征、并与细胞运动、收缩、内吞等功能有关。脊椎动物肌动蛋白分为α、β和γ三种类型，不同种类细胞中肌动蛋白组成不同。肌动蛋白单体为球形，依次连接成链，两串肌动蛋白链互相缠绕扭曲成一股微丝。细胞松弛素B为微丝断裂剂。4.中间纤维：直径介于微丝和微管之间（7~11nm）、由多种不同蛋白组成的细胞骨架细胞生物学实验实验42015/4/13成分。在细胞中围绕着细胞核分布，成束成网，并扩展到细胞质膜，与质膜骨架相连结。主要起机械支撑和加固作用。组成中间纤维的蛋白：角蛋白，波形蛋白，结蛋白、神经纤维，神经胶质纤维和核纤层蛋白。不同组织来源的细胞，组成其中间纤维的蛋白质种类可能不同。5.研究细胞骨架的意义。（1）了解细胞骨架与细胞各种功能行使之间的关系。（2）了解理化因素是否通过影响细胞骨架对细胞功能产生影响，以便趋利避害。（3）鉴定发育中的细胞及肿瘤的来源。6.显示细胞骨架的常用方法：考马氏亮蓝染色法、免疫荧光染色法、鬼笔环肽标记法。（1）考马斯亮蓝染色法原理及特点原理：用去垢剂TritonX-100处理细胞适宜时间，可以溶解膜脂，并与大部分非骨架蛋白疏水区结合而将其溶解，剩下的纤维状细胞骨架蛋白比较稳定而不被溶解，然后用蛋白染料考马斯亮蓝染色即可显示其结构。特点：非特异蛋白染色，不能区分微管、微丝、（2）免疫荧光染色法原理及特点原理：用TritonX-100处理固定处理过的细胞，可增加细胞膜通透性，使抗体能够进入细胞内与细胞骨架蛋白结合。接着用荧光素标记的抗骨架蛋白抗体便可通过直接免疫荧光法或间接免疫荧光法显示骨架。特点：特异显示各种骨架蛋白（3）鬼笔环肽标记法原理及特点原理：鬼笔环肽可特异性地结合肌动蛋白，因此，用荧光素标记的鬼笔环肽可以显示微丝。特点：灵敏，能特异显示微丝。三、实验材料、试剂及用品（一）材料：洋葱（二）试剂中间纤维（1）M-缓冲液。（2）6mM磷酸盐缓冲液（pH6.8）。（3）含1%TritonX-100的M-缓冲液。（4）用M-缓冲液配制的3.0%戊二醛。细胞生物学实验实验42015/4/13（5）0.2%考马斯亮蓝R250染液。（6）0.9%氯化钠生理盐水。（三）用品普通光学显微镜、荧光显微镜、水浴箱（37℃）小剪刀、镊子、5mL一次性塑料注射器、胶头吸管、1.5mLEP管、1.5mL试管架四、实验操作考马斯亮蓝染色法显示洋葱鳞茎内表皮细胞骨架（1）材料准备：撕取洋葱鳞茎内表皮，裁成大小0.5cm×０.５ｃｍ的小片。（2）PBS平衡：放入盛有1mL6mmol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）的EP管中，静置使材料下沉（完全浸透）；然后用胶头滴管吸弃液体。（3）TritonX-100处理：加1mL1%TritonX-100溶液处理20min，然后用胶头滴管吸弃液体。（4）洗涤：用M-缓冲液洗涤3次，每次加1.5mL溶液浸泡5min，然后用胶头滴管吸弃液体。（5）固定：加1mL3.0%戊二醛固定30min,然后用胶头滴管吸弃液体。（6）洗涤：用PBS洗涤3次，每次浸泡5min,然后用胶头滴管吸弃液体。（7）染色：用0.5~1.0mL0.2%考马斯蓝R250染液染色10min。（8）洗涤：用蒸馏水洗涤数遍。（9）制...