19生物化学试验--乙酰丙酮显色法测定血清甘油三酯含量VIP免费

乙酰丙酮显色法测定血清甘油三酯含量【目的】1．掌握乙酰丙酮显色法测定血清甘油三酯含量的实验方法。2．熟悉乙酰丙酮显色法测定血清甘油三酯含量的实验原理。【原理】血清中的甘油三酯，经正庚烷-异丙醇混合剂抽提后，用氢氧化钾溶液皂化水解生成甘油和脂肪酸钾。甘油被过碘酸钠试剂氧化生成甲醛。甲醛与乙酰丙酮在氨离子存在下，加热生成黄色的3.5一二乙酰—1.4一二氢二甲基吡啶衍生物。与同样处理过的三油酰甘油酯标准液进行比色后，求得血清中甘油三酯的含量。此法称为乙酰丙酮显色法又称为Hantzsch化学法，是最经典可靠的测定血清甘油三酯含量的实验方法，也是国内各实验室最多采用的方法。其反应过程如下：1．皂化反应甘油三酯+3KOH→甘油+3RCOOK2．甘油氧化反应甘油+HIO4→HCHO+HCOOH+HIO3+H2O过碘酸甲醛甲酸碘酸3．显色反应【器材】1．分光光度计2．恒温水浴3．微量移液器4．混匀器5．中号试管【试剂】1．抽提剂正庚烷/异丙醇以2/3.5(V/V)比例混合，即正庚烷200ml与异丙醇350ml混匀，置棕色瓶中保存。该试剂在室温下可保存两个月。2．0.04mol/L硫酸溶液取浓硫酸(比重1.84，95%)2.24ml，缓慢加入约100ml蒸馏水中，冷却后再加蒸馏水至1000ml。3．皂化剂取氢氧化钾(分析纯)60g，溶于600ml蒸馏水中，再加异丙醇400ml，混匀，置棕色瓶中保存，于室温下保存可使用两个月以上。4．氧化剂称取过碘酸钠650mg，溶于500ml蒸馏水中，然后加无水醋酸铵77g，溶解后，再加冰醋酸60ml。5．显色剂取4ml乙酰丙酮，加到1000ml异丙醇中，混匀，置棕色瓶中，室温保存。6．三油酸甘油酯标准溶液：（1）贮存液(10mg/ml)：精确称取三油酸甘油酯1.00g，用少量抽提剂溶解后，移入100ml容量瓶中，最后以抽提剂稀释至100ml刻度处。置冰箱中密闭保存。（2）应用液(100mg/dl)：准确吸取上述贮存液10ml加到100ml容量瓶中，以抽提剂稀释至100ml刻度处，置冰箱中密闭保存。7．异丙醇【操作】1．甘油三酯的抽提取干燥洁净的小试管3支，标记，按下表操作。试剂(ml)血清标准应用液蒸馏水0.04mol/LH2SO4抽提剂标准管-0.2-0.52.5测定管0.2--0.52.5空白管--0.20.52.5将以上三管置混匀器上振荡20min，静置分成二层后，吸取各管上层液放入相应的另外3支已做标记的试管中，即为甘油三酯抽提液。2．皂化、氧化及显色另取干燥洁净的小试管3支，标记，按下表操作。试剂(ml)标准管测定管空白管甘油三酯抽提液0.30.30.3异丙醇1.01.01.0皂化剂0.30.30.3充分混匀后置65℃水溶中保温3分氧化剂1.01.01.0显色剂1.01.01.0各管充分摇匀后，置65℃水浴中保温15min，取出冷却后，于波长420nm处，以空白管调0，进行比色，分别读取并记录各管吸光度值。【计算】血清甘油三酯的含量（mg/dl）＝血清甘油三酯的含量（mmol/L）＝【注意事项】1．当吸光度高于0.7时，表示甘油三酯浓度过高，彼此线性关系较差，应以生理盐水将血清稀释后再进行测定。2．显色后15～60min内显色较稳定，应在此时进行比色。若在15min内则显色不完全，若超过60min则显色不稳定。3．本法简单、快速，干扰因素少，不受溶血黄疸影响。4．本法测定正常值为50mg～150mg/dl或0.57～1.69mmol/L。【思考题】1．皂化的目的是什么？抽提液的作用是什么？2．要得到准确的血清甘油三酯含量应注意哪些问题？3．血清甘油三酯的正常浓度是多少？测定其有何临床意义？