乙酰丙酮显色法测定血清甘油三酯含量【目的】1.掌握乙酰丙酮显色法测定血清甘油三酯含量的实验方法。2.熟悉乙酰丙酮显色法测定血清甘油三酯含量的实验原理。【原理】血清中的甘油三酯,经正庚烷-异丙醇混合剂抽提后,用氢氧化钾溶液皂化水解生成甘油和脂肪酸钾。甘油被过碘酸钠试剂氧化生成甲醛。甲醛与乙酰丙酮在氨离子存在下,加热生成黄色的3.5一二乙酰—1.4一二氢二甲基吡啶衍生物。与同样处理过的三油酰甘油酯标准液进行比色后,求得血清中甘油三酯的含量。此法称为乙酰丙酮显色法又称为Hantzsch化学法,是最经典可靠的测定血清甘油三酯含量的实验方法,也是国内各实验室最多采用的方法。其反应过程如下:1.皂化反应甘油三酯+3KOH→甘油+3RCOOK2.甘油氧化反应甘油+HIO4→HCHO+HCOOH+HIO3+H2O过碘酸甲醛甲酸碘酸3.显色反应【器材】1.分光光度计2.恒温水浴3.微量移液器4.混匀器5.中号试管【试剂】1.抽提剂正庚烷/异丙醇以2/3.5(V/V)比例混合,即正庚烷200ml与异丙醇350ml混匀,置棕色瓶中保存。该试剂在室温下可保存两个月。2.0.04mol/L硫酸溶液取浓硫酸(比重1.84,95%)2.24ml,缓慢加入约100ml蒸馏水中,冷却后再加蒸馏水至1000ml。3.皂化剂取氢氧化钾(分析纯)60g,溶于600ml蒸馏水中,再加异丙醇400ml,混匀,置棕色瓶中保存,于室温下保存可使用两个月以上。4.氧化剂称取过碘酸钠650mg,溶于500ml蒸馏水中,然后加无水醋酸铵77g,溶解后,再加冰醋酸60ml。5.显色剂取4ml乙酰丙酮,加到1000ml异丙醇中,混匀,置棕色瓶中,室温保存。6.三油酸甘油酯标准溶液:(1)贮存液(10mg/ml):精确称取三油酸甘油酯1.00g,用少量抽提剂溶解后,移入100ml容量瓶中,最后以抽提剂稀释至100ml刻度处。置冰箱中密闭保存。(2)应用液(100mg/dl):准确吸取上述贮存液10ml加到100ml容量瓶中,以抽提剂稀释至100ml刻度处,置冰箱中密闭保存。7.异丙醇【操作】1.甘油三酯的抽提取干燥洁净的小试管3支,标记,按下表操作。试剂(ml)血清标准应用液蒸馏水0.04mol/LH2SO4抽提剂标准管-0.2-0.52.5测定管0.2--0.52.5空白管--0.20.52.5将以上三管置混匀器上振荡20min,静置分成二层后,吸取各管上层液放入相应的另外3支已做标记的试管中,即为甘油三酯抽提液。2.皂化、氧化及显色另取干燥洁净的小试管3支,标记,按下表操作。试剂(ml)标准管测定管空白管甘油三酯抽提液0.30.30.3异丙醇1.01.01.0皂化剂0.30.30.3充分混匀后置65℃水溶中保温3分氧化剂1.01.01.0显色剂1.01.01.0各管充分摇匀后,置65℃水浴中保温15min,取出冷却后,于波长420nm处,以空白管调0,进行比色,分别读取并记录各管吸光度值。【计算】血清甘油三酯的含量(mg/dl)=血清甘油三酯的含量(mmol/L)=【注意事项】1.当吸光度高于0.7时,表示甘油三酯浓度过高,彼此线性关系较差,应以生理盐水将血清稀释后再进行测定。2.显色后15~60min内显色较稳定,应在此时进行比色。若在15min内则显色不完全,若超过60min则显色不稳定。3.本法简单、快速,干扰因素少,不受溶血黄疸影响。4.本法测定正常值为50mg~150mg/dl或0.57~1.69mmol/L。【思考题】1.皂化的目的是什么?抽提液的作用是什么?2.要得到准确的血清甘油三酯含量应注意哪些问题?3.血清甘油三酯的正常浓度是多少?测定其有何临床意义?