基因组学与蛋白质组学的联系要点VIP免费

基因组学与蛋白质组学的联系要点染色质存在于真核生物细胞核内，由蛋白（组蛋白、酶和转录因子等）以及DNA和RNA分子组成。染色质参与了许多主要生物过程的调节，包括细胞特异性或组织特异性的表达模式、DNA复制及修复、基因表达的机制。了解基因表达在体内如何进行成为现代生物学最诱人的挑战之一。染色质免疫沉淀法（Chromatinimmunoprecitation，ChIP）在这个背景下应运而生，成为目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。与传统的EMSA技术相比，基于体内分析而发展起来的ChIP能更真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前研究基因表达的机制、建立遗传网络、鉴定转录因子和它们的靶点的最常用方法。ChIP还可与DNA芯片和测序技术相结合，用于高通量的筛选已知蛋白因子的未知DNA靶点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况，这将有助于深入理解DNA-蛋白质相互作用的调控网络，了解一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。基因组学和蛋白组学都将把染色质作为研究对象，但两个领域采用的方法各异。在基因组学研究中，研究人员通常从一个蛋白质开始研究，采用ChIP去找出与基因组关联的蛋白质。而蛋白组学研究采用的是反向方法，先用一个特殊的DNA序列作为寻找蛋白质的诱饵；然后用ChIP去证实：那些蛋白质就是在体内与DNA序列相关联的蛋白质。ChIP的原理很简单，就是选择性地富集包含某一特定抗原的染色质片段。传统的ChIP包含以下几个步骤：甲醛处理使蛋白质与DNA交联；超声波将染色质打断成一定大小；通过抗体沉淀蛋白质－DNA交联复合体；用蛋白酶K处理，解除交联，纯化DNA；实时定量PCR检测DNA的量。虽然ChIP技术的原理不复杂，但是对技术的要求高，实验步骤的设计摸索耗时耗力，实验耗费时间长。ChIP实验的几个关键因素：1.抗体对于ChIP实验来说，抗体的选择可以说是至关重要。首先，应该检验抗体的特异性。我们可以用ELISA和Westernblot来确认抗体是否识别特异的表型。但是充分的验证也不能确定抗体一定能在ChIP中起作用，因为交联处理可能会使某些表型改变或丢失。尽量避免使用识别多个抗原的抗体。最好选择ChIP级别的抗体，如果实在找不到，普通IP的抗体也是一个不错的选择。其次，抗体的量和使用的条件都应该根据使用经验来确定。一般情况下可以从每50ugDNA使用2-5ug抗体作为起始条件开始摸索。抗体孵育的时间可根据实际情况缩短或延长，如果细胞数量有限的话，还是推荐孵育过夜吧。2.染色质大部分来源的染色质都适合做ChIP。然而由于来源不同，分离的步骤又随之变化，ChIP可以分为两种类型：天然的和交联的，分别简称为N-ChIP和X-ChIP。(1)N-ChIP：以天然的染色质作为底物。这种方法的好处就是抗原不会在化学交联中被修饰。然而，如果缺乏了交联的步骤，就意味着只有与染色质结合非常紧密的蛋白质能被免疫沉淀，譬如组蛋白。(2)X-ChIP：以交联的染色质作为底物。X-ChIP应用更为广泛的原因就是能用于研究大范围的染色质结合因子，它们与DNA的结合力较弱。它也适用于酵母的ChIP，因为酵母的天然染色质很难制备。然而，确实有一些抗原不适合用X-ChIP这种方式，因为在交联过程中它们的表型会发生变化，或出现包涵体。交联方式通常是甲醛处理。一般需要进行一个时间进程的实验来确定交联的时间。3.超声波打碎DNA在X-ChIP中，超声波处理是打碎DNA最常用的方法，因为甲醛的处理限制了酶切的效果。超声波处理的条件要自己来优化，不过说明书上通常都会给出一个参考条件。注意在整个超声波处理的过程中一定要保持细胞在冰上，且时间不宜太久，否则样品会过热并变性。另外，还要避免产生泡沫，因为泡沫会降低剪切效率。如果出现泡沫，你就要检查一下是不是探头位置不对，刚好接近液面或接触到了管底。染色质免疫沉淀作用在基因组学和蛋白组学研究中的应用越来越广泛。虽然如此，对于使用该技术的新手，它却不是那么容易驾驭的。对于刚刚开始采用ChIP技术的研究人员来说，试剂盒和相关的服务是很有用的，因为技术要求很高。如果不想自己慢慢摸索条件，生物通为你特别介绍市面上主流的商品化产品：R&DR&D最新推出了一系列用于ChIP分析的ExactaChip试...