实验五细胞骨架观察2011.04.20一、实验目的了解用光学显微镜观察植物细胞骨架的原理及方法，观察光学显微镜下细胞骨架的网状结构。二、实验原理细胞骨架（cytoskeleton）是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构，按组成成分和形态结构的不同可分为微管（MT，20－25nm）、微丝（MF，5－7nm）和中间纤维（IF，8－11nm）。它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。光学显微镜下细胞骨架的观察多用1%TritonX－100（聚乙二醇辛基苯基醚，是一种非离子型表面活性剂或称去污剂）处理细胞，可使细胞膜和细胞质中的蛋白质和全部脂质被溶解抽提掉，而细胞骨架系统的蛋白质不受破坏被保存，经戊二醛固定，考马斯亮兰R250（CoomassiebrilliantblueR250是一种蛋白质染料）染色后，用光学显微镜观察，可以见到一种网状结构，即是细胞骨架结构。微管不够稳定，其他类型纤维太细，无法分辨，只能观察到由微丝组成的微丝束（40nm）为网状结构。M缓冲液使细胞骨架中的微丝保持稳定，在M缓冲液中，其中咪唑是缓冲剂EGTA和EDTA螯合Ca离子，溶液并提供Mg离子，在低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张，便于观察。三、实验仪器、材料和试剂（一）仪器、用具：光学显微镜，镊子，剪刀，试管，载玻片，盖玻片，培养皿，烧杯。（二）材料：新鲜洋葱鳞茎。（三）试剂：1．2％考马斯亮蓝R250染色液：0.2g考马斯亮蓝R250粉加入甲醇46.5mL、冰醋酸7mL、蒸馏水46.5mL。2．磷酸缓冲液(pH6.8)：0.2149gNa2HPO4·12H2O、0.0816gKH2PO4加入100ml蒸馏水。3．M缓冲液(pH7.2)50mmol／L咪唑，50mmol/L)氯化钾、0.5mmol／L氯化镁、1mmol/L乙二醇(a-氨基乙基)醚四乙酸、0.1mmol/L乙二胺四乙酸；1mmol／L巯基乙醇，调至pH7.2。4．1%TrionX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)：0.5ml100％TritonX-100加入M缓冲液49.5ml。5．3%戊二醛：6mL25％戊二醛加入磷酸缓冲液44mL。四、实验方法与步骤1．用镊子撕取洋葱鳞叶内侧的表皮若干片约1cm2大小若干片)，置于50mL烧杯中，加入pH6.8磷酸缓冲液，使其下沉；2．吸去磷酸缓冲液，用1％TritonX—100处理20min。3．吸去TritonX—100，用M缓冲液洗3次，每次5min。4．用3％戊二醛固定30min。5．磷酸缓冲液(pH6.8)洗3次，每次5min。6．0.2%考马斯亮蓝R250染色10min。7．蒸馏水洗2次，然后将样品置于载玻片上,加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。8．如果染色效果好，则可依次用50％乙醇、70%乙醇，95％乙醇、正丁醇、二甲苯处理样品，各5min，然后将样品平展于载玻片上，加一滴中性树胶，盖上盖玻片封片，制成永久切片。五、结果光学显微镜下洋葱内表皮细胞的轮廓清晰可见（如图），细胞壁及其分界明显。10×10倍镜下可粗略观察到细胞内粗细不等的蓝色纤维、团块形成的网状结构。同一细胞内各处骨架的密集度不均匀，细胞核区域的纤维相对密集，蓝色浓重，甚至分辨不出网络结构，另外可见细胞壁区域有零星蓝色纤维分布；相邻细胞的密集程度基本一致，但有少数细胞有较大不同。10×40倍镜下可清楚观察到蓝色的网状结构确实由线性纤维交织成，纤维间的结合点稍膨大。细胞边缘骨架较稀疏，但可见由与胞壁相同走向的纤维形成的细胞质膜的轮廓，与细胞内部的纤维通过纵向的纤维相连。相邻细胞有纤维穿过胞间的细胞壁。调节显微镜焦距可观察到细胞不同横切面的网络结构的变化，表明细胞骨架以三维立体结构的形式分布在整个细胞内。
