实验五细胞骨架观察2011.04.20一、实验目的了解用光学显微镜观察植物细胞骨架的原理及方法,观察光学显微镜下细胞骨架的网状结构。二、实验原理细胞骨架(cytoskeleton)是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构,按组成成分和形态结构的不同可分为微管(MT,20-25nm)、微丝(MF,5-7nm)和中间纤维(IF,8-11nm)。它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。光学显微镜下细胞骨架的观察多用1%TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚,是一种非离子型表面活性剂或称去污剂)处理细胞,可使细胞膜和细胞质中的蛋白质和全部脂质被溶解抽提掉,而细胞骨架系统的蛋白质不受破坏被保存,经戊二醛固定,考马斯亮兰R250(CoomassiebrilliantblueR250是一种蛋白质染料)染色后,用光学显微镜观察,可以见到一种网状结构,即是细胞骨架结构。微管不够稳定,其他类型纤维太细,无法分辨,只能观察到由微丝组成的微丝束(40nm)为网状结构。M缓冲液使细胞骨架中的微丝保持稳定,在M缓冲液中,其中咪唑是缓冲剂EGTA和EDTA螯合Ca离子,溶液并提供Mg离子,在低钙条件下,骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张,便于观察。三、实验仪器、材料和试剂(一)仪器、用具:光学显微镜,镊子,剪刀,试管,载玻片,盖玻片,培养皿,烧杯。(二)材料:新鲜洋葱鳞茎。(三)试剂:1.2%考马斯亮蓝R250染色液:0.2g考马斯亮蓝R250粉加入甲醇46.5mL、冰醋酸7mL、蒸馏水46.5mL。2.磷酸缓冲液(pH6.8):0.2149gNa2HPO4·12H2O、0.0816gKH2PO4加入100ml蒸馏水。3.M缓冲液(pH7.2)50mmol/L咪唑,50mmol/L)氯化钾、0.5mmol/L氯化镁、1mmol/L乙二醇(a-氨基乙基)醚四乙酸、0.1mmol/L乙二胺四乙酸;1mmol/L巯基乙醇,调至pH7.2。4.1%TrionX-100(聚乙二醇辛基苯基醚):0.5ml100%TritonX-100加入M缓冲液49.5ml。5.3%戊二醛:6mL25%戊二醛加入磷酸缓冲液44mL。四、实验方法与步骤1.用镊子撕取洋葱鳞叶内侧的表皮若干片约1cm2大小若干片),置于50mL烧杯中,加入pH6.8磷酸缓冲液,使其下沉;2.吸去磷酸缓冲液,用1%TritonX—100处理20min。3.吸去TritonX—100,用M缓冲液洗3次,每次5min。4.用3%戊二醛固定30min。5.磷酸缓冲液(pH6.8)洗3次,每次5min。6.0.2%考马斯亮蓝R250染色10min。7.蒸馏水洗2次,然后将样品置于载玻片上,加盖玻片,于普通光学显微镜下观察。8.如果染色效果好,则可依次用50%乙醇、70%乙醇,95%乙醇、正丁醇、二甲苯处理样品,各5min,然后将样品平展于载玻片上,加一滴中性树胶,盖上盖玻片封片,制成永久切片。五、结果光学显微镜下洋葱内表皮细胞的轮廓清晰可见(如图),细胞壁及其分界明显。10×10倍镜下可粗略观察到细胞内粗细不等的蓝色纤维、团块形成的网状结构。同一细胞内各处骨架的密集度不均匀,细胞核区域的纤维相对密集,蓝色浓重,甚至分辨不出网络结构,另外可见细胞壁区域有零星蓝色纤维分布;相邻细胞的密集程度基本一致,但有少数细胞有较大不同。10×40倍镜下可清楚观察到蓝色的网状结构确实由线性纤维交织成,纤维间的结合点稍膨大。细胞边缘骨架较稀疏,但可见由与胞壁相同走向的纤维形成的细胞质膜的轮廓,与细胞内部的纤维通过纵向的纤维相连。相邻细胞有纤维穿过胞间的细胞壁。调节显微镜焦距可观察到细胞不同横切面的网络结构的变化,表明细胞骨架以三维立体结构的形式分布在整个细胞内。