基因工程实验报告、小麦GAPDH截短体的重组与表达摘要：本实验通过基因工程（geneticengineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。关键字：小麦基因；载体；感受态前言基因工程（geneticengineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。（一）实验过程1.实验部分流程：片段胶的回收小麦幼苗小麦总RNA的提取RT-PCR扩增小麦GAPDH基因pGEX-4T-1质粒提取表达载体的构建表达菌株转化目的蛋白诱导表达目的蛋白Western杂交检测2．小麦总RNA提取（Trizol法）2.1材料小麦幼苗2.2试剂配制及器具处理①0.1％的DEPCH2O（DEPC：焦碳酸二乙酯）②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml的EP管等用纱布包裹，在0.1％的DEPCH2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。③无RNA酶灭菌水（DEPCH2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。④Trizol⑤75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。⑥氯仿(最好用新的)。⑦异丙醇(最好用新的)。2.3操作步骤：①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。②室温放置5min，然后加入200µL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。③12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500µL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm离心10min。④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。⑤重复步骤④。⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30µLDEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。3.RT-PCR扩增目的基因cDNA3.1试剂①RNA模板②Olig（dT）18③反转录缓冲液④dNTP⑤M-MULV反转录酶⑥RNA抑制剂（RNasin）⑦PremixEXTaqDNA聚合酶⑧PCR特异引物3.2操作步骤：3.2.1RNA的反转录采用ThermoScientific（Fermentas）RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKitTotalRNA6µL（需加入RNA约1μg）OligodTprimer1µLH2O（nuclease-free）5µL12µL65℃5min，补加下列试剂：5×Reactionbuffer4µLRibolockRNaseInhibitor1µL10mMdNTPMix2µLRevertAidM-MuLVReverseTranscriptase1µL20µL42℃60min70℃，5min，﹣20℃保存3.2.2PCR扩增目的基因用表达引物扩增目的基因（25µL体系）2×PCRMix12.5µL95℃1min95℃10s58℃20s72℃45s72℃10min16℃∞cDNA1µL引物GA22PDH1-11µL引物GAPDH1-21µLH2O9.5µLtotal25µL35cyclesPCR产物经胶回收。4．核酸琼脂糖电泳分析4.1试剂①TAE缓冲液（50×）：用时需稀释50倍②点样缓冲液Loadingbuffer（10×）：含0.25%溴酚蓝和40%甘油③溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml溴乙啶，注意EB具致癌作用。④琼脂糖4.2操作步骤4.2.1琼脂糖凝胶的制备称1g琼脂糖加入100mlTAE缓冲液中加热熔化。4.2.2胶板制备将凝胶槽清洗干净，在一端插好梳子。然后倒入熔化好的琼脂糖，...
