CentralLaboratoryofBiology水体中大肠菌群的测定微生物学实验第一页，共二十页。CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity【课前预习】1.典型的大肠杆菌群菌落特征是什么？2.食品中大肠菌群数测定的意义是什么？第二页，共二十页。CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity【目的要求】1.学习和掌握大肠菌群的测定方法〔多管发酵法〕2.了解测定过程中每一步的反响原理。3.了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性第三页，共二十页。CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity【实验原理】•大肠菌群是一群能在37℃培养48h内发酵乳糖产酸、产气的需氧或兼氧革兰氏染色阴性无芽抱杆菌。以大肠杆菌为主，包括肠细菌属、柠檬酸细菌属、埃希氏菌属和克雷伯氏菌属等。•大肠菌群在肠道和粪便中数量非常高，且与肠道和粪便中的病原菌生活习性相近，可作为判断样品是否被人、畜粪便污染的标志。第四页，共二十页。CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity发酵法：又称多管发酵法或三步发酵法(此法是根据大肠菌群具有发酵乳糖产酸产气的特性，利用含乳糖的培养基培养不同稀释度的样品经初发酵、平板别离和复发酵3个检测步骤，最后根据结果查最大自然数〔mostprobablenumber〕表，算出食品中的大肠菌群数。)第五页，共二十页。CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity1)初发酵〔推测试验〕：将不同稀释度的水样，分别接种于含有乳糖等糖类的培养液中〔3倍或1倍乳糖培养基，视所加的水样体积和培养基体积而定〕，经37ºC培养24h，观察产酸产气情况，以初步判断是否有大肠菌群存在。第六页，共二十页。CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity•发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置杜氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢菌生长的作用。第七页，共二十页。CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity2〕平皿别离〔证实试验〕•水中除大肠菌群外，尚有其它细菌可能引起糖类发酵，因此需要进一步证实。•将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养基，37ºC培养24h，根据菌落特征，挑取可能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进一步证实是否为大肠菌群。第八页，共二十页。CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity•平板培养基使用伊红美蓝琼脂〔eosinmethyleneblueagar，EMBagar〕。伊红美蓝琼脂平板含有伊红和美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色〔龙胆紫的紫色〕阳性菌落。初发酵管24h内产酸产气和48h产酸产气的均需在以上平板上划线别离菌落。第九页，共二十页。CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity3〕复发酵试验(完成实验〕•将上述可能为大肠菌群的菌落再次转接入1倍乳糖培养液中，经37ºC培养24h，产酸产气者即最后确证为存在大肠菌群。•产酸、产气分别记为阳性反响，不产酸、产气那么记为阴性反响；•根据阳性管数量，查表求得水体大肠菌群的数量。第十页，共二十页。CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity1.被检样品根据不同需要选择检检样品〔如自来水、湖水等〕2.培养基乳糖胆盐发酵培养基，伊红美蓝固体培养基，乳糖发酵培养基3.试剂革兰氏染色液，芽孢染色液4.其它显微镜，天平，培养箱，水浴锅，研钵，平皿，试管，刻度吸管，涂布器【实验材料】第十一页，共二十页。CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity【操作步骤】1．水样的采取〔青山湖水，应取距水面10-15cm的深层水样，用灭菌带玻璃塞的瓶子，瓶口向...
