食品中大肠菌群MPN计数法测定操作规程1目的对公司产品的大肠菌群测定制定标准操作规程，保证公司大肠菌群（MPN法）检测的规范性和检测结果的准确性。2范围本操作规范适用于颐海国际控股有限公司、食品类大肠菌群标准单位为MPN的产品。3依据GB4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》第一法大肠菌群MPN计数法、GB4789.3-2003《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》。4实验原理MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。5仪器和设备微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.1恒温培养箱：36°C±1°C5.2冰箱：2C-5C5.3水浴箱5.4天平：感量0.1g5.5振荡器5.6无菌吸管：1mL、10mL（具0.1mL刻度）及吸头6.培养基和试剂6.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）、乳糖胆盐发酵培养基、伊红美蓝琼脂、乳糖发酵培养基、1mol//LNaOH、1mol/LHCl。7实验步骤依据GB4789.3-2003检测产品（如鸡精）大肠菌群检验程序见图1。fT产弋馨兰氏阳44玄压魄詳牺ft丸晒菌IF9】住PiT^SffiffiYfe血乜±1£.肚ti±1bTLMF^ffrnJKJJzgU1±Sli苹岂氏阴性5EFJS杆酵丈船留!7協性齢兰氏棗包主術弼壽朗忙依据GB4789.3-2016检验其他食品大肠菌群MPN计数的检验程序见图2。Z孔酊脈就岌那Tf3Br±tTC.£4h±2li图27.1样品的稀释7.1.1固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225ml的生理盐水的无菌均质盒内，充分混匀制成1:10的样品匀液。7.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品，放入盛有225ml的生理盐水无菌均质盒内，振摇试管制成1:10的样品匀液。注：样品匀液pH在6.5-7.5之间，必要可用1mol//LNaOH、1mol/LHCl调节。7.1.3用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1ml,沿管壁缓慢注入9ml生理盐水的无菌试管中，振摇试管，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。7.1.4根据对样品污染情况，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液，每递增稀释1次，换用1支lml无菌吸管或吸头，从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。7.2发酵实验鸡精：每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管乳糖胆盐发酵培养基，每管接种ImL（如接种量超过1mL,则用双料乳糖胆盐发酵培养基），36°C±1°C培养24h±2h,观察倒管内是否有气泡产生，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠杆菌群阴性，如有产气则进行复发酵。其他样品：每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液）每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml（如接种量超过1ml,则用双料LST肉汤），36C±1培养24±2h,产气则进行复发酵，未产气继续培养至48h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，产气者为阳性，未产气者为大肠菌群阴性。7.3复发酵实验鸡精：将产气的发酵管分别接种在伊红美蓝琼脂平板上，置于36C±1C恒温箱内，培养18h-24h,然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实实验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群落1个-2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置于36C±1C培养箱内培养24h±2h,观察产气情况，凡乳糖管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌即可报告为大肠杆菌阳性。其他食品:用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36C±1C培养48h±2h,观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。7.4大肠菌群最可能数（MPN）的报告按7.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表，报告样品中大肠菌群的MPN值。其中依据GB4789.3-2003检测产品（如鸡精）使用表1,报告每100g（ml）样品中大肠菌群的MPN值。依据GB4789.3-2010其他食品使用表2,报告每g（ml）样品中大肠菌群的MPN值。大肠菌群最可能数（MPN）检索表：舉1ftlfttfftMFNIDOvnL/砒1RLCI?X3口]mill龄$0.-01mU口舛3T阳±p0I勺fl<33Q1<5soC■b£4<1a1铀o■03De]1袖4130]3ISDE{]师4L1HJ42E1岡0t¥XED0d召帅I勺.m1L34D331HD33LHD"■辿就df屮耳屮四+...
