土壤中放线菌的分离与纯化VIP免费

土壤中放线菌的分离与纯化实验目的1掌握放线菌的生长特性，微生物的培养方法。2掌握微生物实验的基本生物技术，主要包括无菌操作技术，纯种分离技术，纯种培养技术，以及抗生素检测等。3掌握合成培养基，选择培养基的制备方法。4学习对微生物实验的中出现问题的分析，解决方法实验材料药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、琼脂、重铬酸钾其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。实验原理放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。放线菌可以产生抗生素，抑制其他菌种的生长，故可用金黄色葡萄球菌（G+）和大肠杆菌（G-）作指示菌鉴别放线菌。高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3、NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O作为无机盐，FeSO4•7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成1.高氏一号合成培养基的制备K2HPO4•3H2O0.125g，可溶性淀粉5g，硝酸钾0.25,MgSO4•7H2O0.125g，FeSO4•7H2O0.025g，氯化钠0.125g，琼脂5g，水250ml。配制时，先依次加入上述药品（除琼脂外）顺序溶解，加入无菌水至250ml，调节pH＝7.4，再加入琼脂不断搅拌震荡至溶化后，121℃灭菌20分钟。将6套平皿、12只试管灭菌。2.土壤中放线菌的分离1．编号，分装：取6套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-3、10-4、10-5）。每个稀释度做两个培养皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷凝至50℃左右的高氏一号培养基15~20ml左右，待冷凝成平板。另取5支盛有9ml一只盛有10ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。2．稀释倾注分离称1g土样放入10ml无菌水试管中振荡10min，即10-1的土壤悬液，静置30s。用无菌吸管无菌操作取10-1浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-2的无菌试管中，并吹吸吸管2~3次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。即为10-2浓度的土壤稀释液。依此类推，直到稀释至10-5的试管中（每个稀释度换1支无菌吸管）。如图3．倒平板分离培养于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45℃左右的高氏培养基约10—15ml，置水平位置，迅速旋动混匀，待凝固。（若融化的培养基温度太高，会产生太多的冷凝水，影响观察。）用1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液1ml，对号放入编好号的无菌培养皿中，每一浓度对应两个平板。用无菌涂布棒（从浓度小液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌。稀释涂布平板法4培养接种完毕，将平皿和试管放入28℃恒温箱培养7天，观察平皿上放线菌（主要是链霉菌）菌落。菌种纯化1、倒平板将加热融化的高氏一号合成培养基倒平板，并标号。2、平板划线划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种：图Ⅴ-3划线分离示意图⑴分区划线用接将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁刮取少许菌苔，在平板培养基的一边，作第1次平行划线6～7条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线(图Ⅴ-3)，然后再用同样方法，...