Western Blot蛋白免疫印迹法VIP免费

3Westernblot3.1试剂配制1）30%聚丙烯酰胺储备液（Acr/Bis）:丙烯酰胺（Acr）,29g；N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）,lg,去离子水溶解，37°C水浴助溶，定容至100mL。0.45》m滤器过滤，棕色瓶4C避光保存。2）10%十二烷基硫酸钠（SDS）：SDS,10g；H2O,80mL。68C加热溶解，浓HC1调pH至7.2，定容至100mL,室温保存。3）10%过硫酸铵（AP）：AP，1g；H2O，10mL。避光，4C保存。（4C2周）4）分离胶缓冲液（1・5MTris-HClpH8・8）：Tris，18.17g；H2O80mL。用浓HC1调pH至8.8，定容至100mL，4C保存。5）浓缩胶缓冲液（1・0MTris-HClpH6・8）：Tris，12.11g；H2O80mL。用浓HC1调pH至6.8，定容至100mL，4C保存。6）电泳缓冲液（10X）：甘氨酸（Glycine），188g；Tris30.2g；SDS，10g；H2O,800mL。调节pH至8.3,定容至1L,4C保存（用时稀释为1X）。7）5XSDS-PAGEloadingBuffer（5mL）：1MTris-HCl（pH6.8）,1.25mL；SDS,0.5g；溴酚蓝（BPB）,25mg；甘油，2.5mL；加去离子水定容至5mL。充分混匀，分装成500》L/份，室温保存。使用前每份加入25pLp-巯基乙醇（2-ME）,加入2-ME的loadingbuffer可在室温下保存一个月左右。8）考马斯亮蓝染色固定液：40%双蒸水，10%醋酸,50%甲醇，室温保存9）考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-250,250mg；甲醇，45ml；冰醋酸，10ml；H2O,定容至100ml。室温保存。10）考马斯亮蓝染色脱色液：醋酸，100ml；乙醇，50ml；dH2O850ml，充分混合，室温保存11）膜转移缓冲液：甘氨酸，2.9g；Tris,5.8g；SDS,0.37g；加H2O600mL充分溶解，加200mL甲醇，混匀，定容至1L,室温保存。12）TBS缓冲液：NaCl,8.8g；1MTis-HCL（pH8.0）,20ml,加入约800H2O搅拌溶解，定容至1L,4°C保存。13)TBST缓冲液：NaCl,8.8g；IMTis-HCL(pH8.0),20ml,加入约800H2O搅拌溶解，加入0.5mlTween20后充分混匀，去离子水定容至1L,4C保存。14)1MTis-HCL(pH8.0)：Tris121.1g置于1L烧杯，加入约800ml去离子水，充分搅拌，加入浓HCL约42ml，定容至1L，高压灭菌，室温保存。3・2Westernblot电泳、转膜及显色过程3・2・1清洗将玻璃板洗净，用ddH2O冲洗，然后晾干。封板时保证支架与底座胶条契合，固定时两边同时均匀用力旋动齿轮把手，固定即可，不要用力过大以免压碎玻璃。封好后可装ddH2O试试，确定不漏后再灌胶。2、制胶①SDS-PAGE分离胶配方表(12%Gel)各种组分名称各种凝胶体积对应的各种组分的取样量(ml)10ml15ml20mlH2O3.34.96.630%Acrylamide4.06.08.01.5MTris-Hcl(pH8.8)2.53.85.010%SDS0.10.150.210%过硫酸铵(AP)0.10.150.2TEMED0.0040.0060.008②SDS-PAGE浓缩胶(5%Acrylamide)配方表各种组分名各种凝胶体积对应的各种组分的取样量(ml)称4ml5ml6mlH2O2.73.44.130%Acrylamide0.670.831.01.0MTris-Hcl0.50.630.75(pH6.8)10%SDS0.00.050.0610%过硫酸铵0.00.050.06TEME0.000.000.003、封胶①按前面方法配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。②当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了（至少等30-40min）。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。③按前面方法配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。4、拔梳子灌好浓缩胶，约40-60min凝胶后均匀用力拔除梳子，若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正。5、上样①测完蛋白浓度后，计算含M蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至5离心管中，加入5XSDS上样缓冲液至终浓度为IX。将加入loadingbuffer的蛋白样品放沸水中煮5-10分钟，高速离心30s即可上样。上样总体积一般不超过15p,加样孔的最大限度可加|J体积。②加足够的电泳液后开始准备上样，电泳液至少要漫过内测的小玻璃板，外侧漠过底部...